循環(huán)腫瘤細(xì)胞在前列腺癌診斷中的價(jià)值

周旭東 趙興華 許長(zhǎng)寶 郝斌 李武學(xué) 趙永立

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科（鄭州450000）

前列腺癌是泌尿外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在美國(guó)前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)肺癌成為第一位危害男性健康的腫瘤［1］。近年來(lái)，隨著人們生活水平及生活方式的改變，前列腺癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢(shì)。由于前列腺癌臨床癥狀不明顯，發(fā)病隱匿，診斷率低，發(fā)生、發(fā)展以及治療復(fù)雜，嚴(yán)重危害男性健康，因此對(duì)前列腺癌患者進(jìn)行進(jìn)行早期篩查診斷以及干預(yù)治療顯得尤為重要［2-3］。目前的診斷方法主要包括直腸指診（DRE），前列腺特異抗原（PSA）以及穿刺活檢，但這些方法存在一定的不足，無(wú)法早期準(zhǔn)確全面的評(píng)估患者的病情。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）作為一種非侵入性的新型診斷標(biāo)志，有助于腫瘤微轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)后評(píng)估，在治療檢測(cè)以及個(gè)體化治療中具有重要的臨床意義［4-5］。目前，有研究表明CTCs 檢測(cè)有助于前列腺癌的早期診斷，但尚無(wú)研究確定其最佳臨界值，并且缺乏與PSA 的隨機(jī)對(duì)照研究［6］。本文旨在評(píng)估CTCs 水平與前列腺癌患者臨床指標(biāo)、病理評(píng)分等的相關(guān)性，探討CTCs 檢測(cè)在前列腺癌初步診斷和預(yù)后判斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年9月至2019年9月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科住院治療的78 例前列腺癌患者作為研究組，年齡68 ～89 歲，平均年齡（73.54 ± 6.17）歲。選擇同期于我院體檢的健康人群35 例作為對(duì)照組，年齡67 ～87 歲，平均年齡（73.28 ± 6.12）歲。所有研究組患者均進(jìn)行前列腺穿刺活檢，記錄Gleason評(píng)分結(jié)果，其中36例行前列腺癌根治性切除術(shù)，記錄病理分期結(jié)果；所有入選者均知曉本次研究并自愿簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他腫瘤病史者；（2）合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者；（3）合并血栓性疾病、感染性疾病者；（4）1 周內(nèi)血透、輸血以及使用凝血藥物者；（5）有長(zhǎng)期激素服用史或者1個(gè)月內(nèi)有手術(shù)創(chuàng)傷病史者。

1.2 方法

1.2.1 CTCs 檢測(cè)本研究應(yīng)用CanPatrolTM二代CTC 檢測(cè)技術(shù)對(duì)所有研究對(duì)象外周血進(jìn)行CTCs檢測(cè)，步驟如下：（1）樣本采集：使用8 號(hào)采血針采集外周血樣本7.5 mL 置于EDTA 抗凝采血管，并進(jìn)行預(yù)處理；（2）CTC 富集：將預(yù)處理樣本于過(guò)濾器中進(jìn)行抽濾，利用CTC 和白細(xì)胞的大小差異進(jìn)行分離和富集；（3）基因探針雜交：使用DAPI 核染色和CD45、上皮型和間質(zhì)型mRNA 進(jìn)行雜交；（4）信號(hào)標(biāo)記探針雜交：使用標(biāo)記有熒光免疫的標(biāo)記針與擴(kuò)增探針進(jìn)行雜交，產(chǎn)生熒光信號(hào)；（5）識(shí)別：利用自動(dòng)成像熒光顯微鏡閱讀熒光信號(hào)。DAPI 陽(yáng)性、CD45 陰性、間質(zhì)型標(biāo)志物波形蛋白和扭曲蛋白或上皮型標(biāo)志物EpCAM 和細(xì)胞角蛋白8/18/19陽(yáng)性則判定為CTC。根據(jù)國(guó)內(nèi)外參考文獻(xiàn)［7］，定義CTCs ≥5個(gè)/7.5 mL外周血為CTCs陽(yáng)性，＜5個(gè)/7.5 mL外周血為CTCs 陰性。

1.2.2 資料采集所有入組對(duì)象記錄年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、既往病史、生活習(xí)慣（吸煙史、飲酒史）、血紅蛋白（HB）、血小板（PLT）、纖維蛋白原（FIB）、D-二聚體（D-D）、白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）、前列腺特異抗原（PSA）、前列腺磁共振（MRI）、骨掃描、腹部CT 等結(jié)果；研究組記錄前列腺穿刺活檢后Gleason 評(píng)分結(jié)果并記錄36 例行前列腺癌根治術(shù)后患者的病理分期結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組和對(duì)照組一般資料及CTCs 陽(yáng)性率比較兩組年齡、BMI、高血壓史、高血脂癥史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），研究組CTCs 陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。研究組中41 例發(fā)生前列腺癌轉(zhuǎn)移，其中CTCs 陽(yáng)性者24 例（58.54%）；37 例未發(fā)生前列腺癌轉(zhuǎn)移，其中CTCs 陽(yáng)性者8 例（21.62%），前者較后者CTCs 陽(yáng)性率顯著升高（χ2=10.954，P=0.001）。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料及CTCs 陽(yáng)性率比較Tab.1 Comparison of general data and CTCs positive rate between the two groups 例（%）

2.2 血清CTCs、PSA 水平對(duì)前列腺癌的診斷價(jià)值以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，利用四格表預(yù)測(cè)CTCs、PSA 對(duì)前列腺癌的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，靈敏度分別為88.46%、85.89%，特異度分別為74.28%、65.71%，準(zhǔn)確率分別為84.07%、79.64%，見(jiàn)表2、3。

表2 CTCs 和PSA 對(duì)前列腺癌的診斷結(jié)果Tab.2 CTCs and PSA diagnosis of prostate cancer 例

2.3 前列腺癌患者CTCs 陽(yáng)性組和陰性組生化指標(biāo)比較前列腺癌患者CTCs 陽(yáng)性組HB、ALB 水平明顯低于CTCs 陰性組（P＜0.05），PLT、FIB、D-D、AKP、LDH 水平明顯高于CTCs 陰性組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表4。

2.4 研究組CTCs與PSA和Gleason評(píng)分的相關(guān)性分析Pearson 法分析顯示，CTCs 與PSA、Gleason評(píng)分均呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.601，P＜0.05；r=0.316，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

表3 CTCs、PSA 診斷前列腺癌的效果Tab.3 The effects of CTCs and PSA in diagnosis of prostate cancer %

表4 CTCs 陽(yáng)性組和陰性組生化指標(biāo)比較Tab.4 Comparison of biochemical indexes between CTCs positive group and negative group ±s

表4 CTCs 陽(yáng)性組和陰性組生化指標(biāo)比較Tab.4 Comparison of biochemical indexes between CTCs positive group and negative group ±s

生化指標(biāo)HB（g/L）PLT（×109/L）FIB（g/L）D-D（μg/L）ALB（g/L）AKP（U/L）LDH（U/L）CTCs 陽(yáng)性組（n=32）109.14±5.64 210.97±12.52 4.61±0.29 349.57±26.43 34.17±1.02 118.62±14.23 192.46±12.57 CTCs 陰性組（n=46）132.71±6.06 164.73±10.79 3.24±0.26 271.32±22.85 39.49±1.08 82.38±10.27 184.73±10.13 t 值17.377 17.426 21.830 13.947 21.887 13.072 3.001 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.004

2.5 36 例前列腺癌手術(shù)患者CTCs 與病理分期的關(guān)系根據(jù)前列腺癌根治手術(shù)標(biāo)本的病理分期，將36 例手術(shù)患者分為Ⅰ期6 例、Ⅱ期12 例、Ⅲ期14 例和Ⅳ期4 例，各組患者年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PSA 水平隨分期惡化程度加重而增加；CTCs 個(gè)數(shù)亦隨病理分期惡化程度加重而增加，見(jiàn)表5。

表5 36 例手術(shù)患者CTCs 與病理分期的關(guān)系Tab.5 Relationship between CTCs and pathological stage in 36 surgical patients ±s

表5 36 例手術(shù)患者CTCs 與病理分期的關(guān)系Tab.5 Relationship between CTCs and pathological stage in 36 surgical patients ±s

注：與Ⅰ期相比，aP ＜0.05；與Ⅱ期相比，bP ＜0.05

病理分期Ⅰ期Ⅱ期Ⅲ期Ⅳ期F 值P 值例數(shù)6 12 14 4年齡（歲）72.64±4.12 73.42±4.10 73.69±4.13 74.07±4.21 0.084 0.968 PSA（ng/mL）14.16±2.27 19.53±2.65a 22.46±4.94a 38.57±5.17ab 34.76＜0.001 CTCs（個(gè)）5.18±2.03 6.31±2.11 7.64±1.84 8.79±1.02b 3.513 0.026

3 討論

CTCs 是指從腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶經(jīng)過(guò)主動(dòng)或者被動(dòng)方式入血并逃過(guò)了免疫殺傷而存活下來(lái)的腫瘤細(xì)胞［8］。作為液體活檢中應(yīng)用較早的一種，CTCs 檢測(cè)可以及時(shí)反映原發(fā)腫瘤的發(fā)展情況，輔助判斷病情的進(jìn)展，并且具有無(wú)創(chuàng)、便捷、可重復(fù)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)［9］。

圖1 CTCs 與PSA（A）和Gleason 評(píng)分（B）的相關(guān)性Fig.1 Correlation of CTCs with PSA（A）and Gleason score（B）

前列腺穿刺活檢是前列腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，臨床上對(duì)于是否行前列腺穿刺活檢主要是通過(guò)PSA 水平來(lái)界定的［10］，但PSA 是組織特異性而非腫瘤特異性，并且干擾PSA 結(jié)果的因素較多，國(guó)內(nèi)有研究［11］顯示PSA 在10 ～20 ng/mL 之間的258 例穿刺活檢患者，癌檢出率僅為33.3%，并且前列腺穿刺活檢作為一種侵入性的檢查方法，無(wú)法監(jiān)測(cè)原發(fā)腫瘤的變化。而CTCs 由于和腫瘤原發(fā)灶具有相似的基因型和表型，相較于PSA 檢測(cè)具有更高的特異性，相較于前列腺癌穿刺活檢，CTCs 檢測(cè)更快捷，微創(chuàng)，并且能動(dòng)態(tài)反應(yīng)病情變化［12-13］。從1869年ASHWORTH［14］首次發(fā)現(xiàn)CTCs 至今已有150 余年，但由于檢測(cè)技術(shù)不足，CTCs 在臨床中的應(yīng)用受到限制。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，CTCs 在腫瘤的早期診斷、轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)和療效觀察以及腫瘤個(gè)體化治療等各方面的應(yīng)用均得以迅猛發(fā)展［15-16］。本研究基于CanPatrolTM二代CTC 檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)CTCs，是應(yīng)用免疫去除結(jié)合納米過(guò)濾法的第二代CTCs 富集技術(shù)，不需要依靠特異抗體捕獲，對(duì)腫瘤細(xì)胞的回收率超過(guò)80%。本研究結(jié)果顯示，研究組患者CTCs 陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組，前列腺癌轉(zhuǎn)移患者CTCs 陽(yáng)性率顯著高于非轉(zhuǎn)移患者。以病理結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，利用四格表預(yù)測(cè)CTCs 對(duì)前列腺癌的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示CTCs、PSA對(duì)前列腺癌的診斷靈敏度分別88.46%、85.89%，特異度分別為74.28%、65.71%，準(zhǔn)確率分別為84.07%、79.64%，提示血清PSA、CTCs 對(duì)前列腺有一定的診斷價(jià)值，且CTCs 對(duì)前列腺癌的診斷價(jià)值優(yōu)于PSA。惡性腫瘤需依賴(lài)宿主生長(zhǎng)，在增殖過(guò)程中會(huì)引起低白蛋白血癥以及貧血等癥狀，造成患者營(yíng)養(yǎng)不良、病情加重，而腫瘤患者約20%直接死于營(yíng)養(yǎng)不良［17-18］。有研究［19］表明，ALB 與HB 作為評(píng)估營(yíng)養(yǎng)狀況與貧血的主要指標(biāo)，與腫瘤患者術(shù)后并發(fā)癥以及死亡率有關(guān)。本研究顯示，前列腺癌CTCs 陽(yáng)性組HB、ALB 水平明顯低于CTCs 陰性組，提示CTCs 陽(yáng)性組患者營(yíng)養(yǎng)狀況較差，預(yù)后不佳。有研究［20］報(bào)道，PLT 的升高在惡性腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起促進(jìn)作用，F(xiàn)IB、D-D 的升高與惡性腫瘤疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究中，CTCs 陽(yáng)性組PLT、FIB、D-D 較CTCs 陰性組明顯升高，說(shuō)明CTCs陽(yáng)性患者血液處于高凝狀態(tài)，可促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此，通過(guò)對(duì)CTCs 計(jì)數(shù)的檢測(cè)有助于早期發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者血液的高凝狀態(tài)，并通過(guò)CTCs 計(jì)數(shù)的變化間接的預(yù)測(cè)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。有學(xué)者研究［21］發(fā)現(xiàn)，前列腺癌骨轉(zhuǎn)移患者AKP 水平明顯升高，而AKP 是預(yù)測(cè)前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。LDH 是糖酵解的主要酶類(lèi)，由于惡性腫瘤細(xì)胞的能量需求較正常組織細(xì)胞顯著增多，細(xì)胞通透性增加，導(dǎo)致LDH 酶進(jìn)入血循環(huán)，從而引起血清LDH 水平升高［22-23］。本研究結(jié)果顯示與CTCs 陰性組相比，CTCs 陽(yáng)性組AKP、LDH 水平明顯升高，提示CTCs 陽(yáng)性組患者腫瘤惡性程度較高，病情較CTCs 陰性組更嚴(yán)重，可能作為輔助判斷前列腺癌進(jìn)展的潛在指標(biāo)。

PSA 一直以來(lái)都是作為前列腺癌診斷以及預(yù)后判斷的重要指標(biāo)之一，有研究［24］證實(shí)CTCs 水平與PSA水平呈正相關(guān)。本研究中，CTCs水平與PSA呈顯著正相關(guān)，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示CTCs可以作為前列腺癌的早期診斷以及預(yù)后評(píng)估的潛在指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，CTCs 水平與Gleason 評(píng)分呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，且CTCs 與病理分期具有明顯相關(guān)性，與CIELIKOWSKI 等［25］研究結(jié)果一致。隨著病理分期的增加，CTCs 個(gè)數(shù)也明顯增加，但CTCs能否作為獨(dú)立預(yù)測(cè)因素或者與某些預(yù)測(cè)因子聯(lián)合用于前列腺癌Gleason 評(píng)分以及病理分期評(píng)估仍需要臨床大樣本的試驗(yàn)研究。

CTCs 作為一種無(wú)創(chuàng)、便捷、可重復(fù)檢測(cè)的新型診斷指標(biāo)，對(duì)前列腺癌的早期診斷、療效觀察、預(yù)后判斷具有一定的臨床價(jià)值。目前關(guān)于CTCs 檢測(cè)在臨床實(shí)際應(yīng)用中最大的問(wèn)題是檢測(cè)技術(shù)的局限性，以及需要更大樣本量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以期得到更客觀準(zhǔn)確的結(jié)論，這也是本研究組后續(xù)研究的方向。