一株防治黃瓜霜霉病的地衣芽孢桿菌HS10的防病機理初探

鄭 麗 ，徐 龍，羅玉明，劉紅霞，郭堅華

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 植物健康創(chuàng)新研究院/農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/江蘇省生物源農(nóng)藥工程中心，江蘇 南京 210095；3.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 淮安 223001；4.中化現(xiàn)代農(nóng)業(yè)安徽有限公司，安徽 合肥 240041）

【研究意義】由古巴假霜霉菌（Pseudoperonospora cubensis）引起的黃瓜霜霉病，在高溫高濕的溫室環(huán)境下流行快、發(fā)病重、防治難度大，成為生產(chǎn)中重要的病害之一［1-2］?？剐云贩N的選育周期長，病害防治過多依賴化學(xué)藥劑，而化學(xué)農(nóng)藥的反復(fù)使用又極易產(chǎn)生抗藥性［3］?！厩叭搜芯窟M展】植物病害生物防治是利用有益微生物及其代謝物，對農(nóng)作物病害進行有效防控的方法與技術(shù)［4］。芽孢桿菌（Bacillussp.）具有豐富的多樣性、分布廣泛、抗菌譜廣等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于病害的生物防治，包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）等。枯草芽孢桿菌研究最為深入，而關(guān)于地衣芽孢桿菌防病機理的報道相對較少。隨著社會對農(nóng)藥殘留問題的重視，中高毒性的化學(xué)農(nóng)藥不斷被禁用、限用，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部啟動“減肥減藥”行動，生物農(nóng)藥的開發(fā)得到快速發(fā)展。生物農(nóng)藥“寧盾”［5］、“武夷菌素”［6］、“綠盾豐”、“雙抗”或其他活體生防菌劑，主要是利用植物的天然代謝物或生防菌株的發(fā)酵液及其次生代謝產(chǎn)物，防效大多在50%～70%［7-8］。此外，還有關(guān)于植物類提取液［9］、生物活性蛋白［10］、寡糖［11］等應(yīng)用型研究。

【本研究切入點】據(jù)已有研究可知，地衣芽孢桿菌對農(nóng)作物的真菌性病害如辣椒疫霉菌菌（P.capsici）［12］，油菜核盤?。⊿clerotinia sclerotiorum）［13］，柑橘炭疽?。–olletotrichum gloeosporioidesPenz.）、蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola）［14］及桃枝枯?。≒homopsis amygdali）［15］等有較好的防治效果，生防菌能夠通過多種途徑促生防病?！緮M解決的關(guān)鍵問題】前期獲得一株對黃瓜霜霉病（P.cubensis）防效較好的地衣芽孢桿菌HS10，擬進一步檢測該菌株的廣譜室內(nèi)平板抑菌活性和對同類疫霉菌病害的防效，通過檢測該菌株的胞外粗蛋白對病害表現(xiàn)的防效，以及對植物抗病相關(guān)酶活性的影響，初步探究其可能的防病機理。

1 材料與方法

1.1 菌株培養(yǎng)和植物材料

HS10菌株培養(yǎng)：將-70 ℃冰箱的菌株劃線在LB固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種到液體LB（氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，調(diào)節(jié)pH=7.2，瓊脂粉15 g/L）中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h，當(dāng)培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8時，將種子液以1∶500體積比加入至500 mL培養(yǎng)液中，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

病原菌培養(yǎng)：稻瘟病菌、辣椒疫霉菌使用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g/L，切碎加水煮沸20 min，濾液中加入蔗糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L）、霜疫霉菌采用胡蘿卜培養(yǎng)基（胡蘿卜 200 g，去皮后榨汁，汁液雙層紗布過濾，定容至1 L，加瓊脂 15 g），25 ℃培養(yǎng) 5～7 d。

植物材料及培養(yǎng)：供試黃瓜品種為津優(yōu)35，將黃瓜種子進行表面消毒（70%無水乙醇表面消毒1～2 min，0.05%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，滅菌水潤洗5次），播種于育苗盤中在28 ℃、16/8 h光周期、70%以上相對濕度的溫室培育。待黃瓜苗長到3～4片真葉（25 d左右）進行移栽。將黃瓜幼苗移栽裝滿基質(zhì)的盆缽中，每盆1株，置于28 ℃、相對濕度85%以上、光周期16/8 h的溫室培養(yǎng)。荔枝品種為廣州從化85%成熟度的糯米糍。

1.2 HS10菌株室內(nèi)平板抑菌作用測定

通過對峙培養(yǎng)方法測試菌株的頡頏作用。將病原菌菌絲塊分別接種于PDA培養(yǎng)基中心，在其四周距中心約27 mm處接種HS10菌株，4次重復(fù)，每個重復(fù)3個培養(yǎng)皿。28 ℃培養(yǎng)5～7 d，待對照菌絲長滿平板后，記錄抑菌帶的大小。

1.3 HS10菌株對荔枝采后霜疫病的防治效果試驗

試驗設(shè)5.0×107CFU/mL生防菌HS10發(fā)酵培養(yǎng)液和1/10 LB液體2個處理。采后室內(nèi)防效測定：田間采摘健康的糯米糍果實（廣州從化某農(nóng)戶，約85%成熟度，2016年6月），每個處理3 L菌液或LB浸泡果實，24 h后接種濃度為5×104個/mL荔枝霜疫霉菌孢子囊。每個處理4次重復(fù)，每個重復(fù)30個果實。接種后72 h調(diào)查病情指數(shù)。

田間防效測定：田間約75%成熟度的淮枝果實（廣州花都區(qū)四聯(lián)村某農(nóng)戶，2016年6月）噴霧處理，3 d后田間噴霧接種病原菌，噴霧時加入終濃度為0.01%表面活性劑Tween-20。接種后90 h調(diào)查病情指數(shù)。病害調(diào)查和病害統(tǒng)計參照Zheng等［16］的方法。

1.4 HS10粗蛋白對黃瓜霜霉病的防治效果試驗

1.4.1 粗蛋白提取 按上述方法培養(yǎng)菌體，6 000 r/min離心10 min，收集上清，使用80%硫酸銨沉淀上清液，獲得粗蛋白［13］。利用BSA牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍法檢測HS10-Protein蛋白濃度，調(diào)整終濃度至50 μg/mL噴施。

1.4.2 粗蛋白對黃瓜霜霉病的防效檢測 試驗設(shè)粗蛋白和無菌水2個處理，每個處理4次重復(fù)，每個重復(fù)60棵苗，隨機區(qū)組排列，小區(qū)之間以4株黃瓜苗作為保護行。施藥方法采用小噴壺噴霧至每片黃瓜葉片上布滿液滴，重點噴施葉背。大棚霜霉病自然發(fā)生，藥后8 d開始調(diào)查病情指數(shù)。日光溫室大棚及土壤結(jié)構(gòu)、病情指數(shù)統(tǒng)計和防治效果參照Zheng等［17］的方法

1.4.3 粗蛋白對辣椒疫霉菌絲生長的影響 將在PDA平板、25 ℃培養(yǎng)4 d的辣椒疫霉菌，接種至50 mL液體PDA培養(yǎng)基中，100 r/min、25 ℃培養(yǎng)2 d后，加入終濃度2.5 mg/mL粗蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，挑取菌絲進行顯微鏡觀察。

1.5 HS10預(yù)處理對黃瓜葉片PAL和POD活性測定

1.5.1 黃瓜葉片處理 參照Zheng等［17］的方法培育黃瓜苗，待其長出10片真葉后在溫室進行噴霧處理。試驗設(shè)1.0×107CFU/mL HS10菌懸液和無菌水2個處理，在噴霧時均加入終濃度為0.01%表面活性劑Tween-20。每個處理4次重復(fù)，每個重復(fù)24棵苗，每棵苗噴施至葉面可見液滴為準(zhǔn)（約30～60 mL）。取樣時間為處理后 0、3、6、12、24、36、48 h。

1.5.2 粗酶液提取 準(zhǔn)確稱量黃瓜葉片（去葉柄）0.5 g，剪碎，加入5.0 mL、0.050 mol/L硼酸緩沖液（含5 mmol/L巰基乙醇，1 mmol/L EDTA，pH=8.7），0.05 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），在冰浴中研磨成勻漿，于4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，即為粗酶液。

1.5.3 PAL活性測定 粗酶液用KOH調(diào)節(jié)pH=8.9，21 μL上清中加14 μL STO緩沖液和7 μL 60 mmol/L L-苯丙氨酸，40 ℃溫水浴反應(yīng)1 h，冰浴停止反應(yīng)。測定OD290值（以每分鐘OD290值變化0.01所需酶量為1 U），計算酶活性（U/g·min）：

式中，△A290為單位反應(yīng)時間內(nèi)吸光度值的變化，VT為酶提取液總體積（mL），VS為測定時取用的酶液體積（mL），W為樣品鮮重（g），t為反應(yīng)時間（min）。

1.5.4 POD活性測定 500 μL反應(yīng)體系中，含0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH=6.1），4 mmol/L愈創(chuàng)木酚，3 mmol/L H2O2，20 μL粗酶提取物，測定OD470值（以每分鐘OD470值變化0.01所需酶量為1 U）。POD活性用辣根過氧化物酶標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)定，計算公式同1.5.3。

在Microsoft Excel中對試驗數(shù)據(jù)進行基本處理后，采用DPS7.05軟件進行單因素方差分析，采用LSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS10菌株對病原真菌的頡頏作用

HS10菌株對稻瘟病菌抑菌圈半徑為14.3 mm，頡頏效果較好；對霜疫霉菌和辣椒疫霉菌抑菌圈半徑分別為12.8、12.3 mm，頡頏效果次之；對炭疽病菌和草莖點霉菌抑菌圈半徑分別為2.5、1.5mm［18］，但對小孢擬盤多毛孢無抑菌圈（表1）?？梢?，該菌株對不同病原真菌的頡頏能力存在差異。

表1 HS10菌株對多種病原真菌的頡頏作用Table 1 Antagonism of HS10 strain against various pathogenic fungi

2.2 HS10菌棟對荔枝霜疫病的防治效果

采后荔枝果實在室內(nèi)常溫條件下，接種病原菌72 h，HS10處理病情指數(shù)僅為15.52，而對照則為41.23，防效達到62.36%，能有效減輕霜疫病發(fā)生。田間試驗發(fā)現(xiàn)，接種后90 h，HS10處理病情指數(shù)為34.14，對照為63.22，防效為46%（表2）。可見，該菌株對荔枝霜疫病表現(xiàn)較好的防治效果。

2.3 HS10菌體粗蛋白的作用分析

2.3.1 對黃瓜霜霉病的田間防效 HS10菌株粗蛋白（濃度為50 μg/mL）噴霧預(yù)處理日光溫室黃瓜后，發(fā)現(xiàn)對黃瓜霜霉病防效可達60.08%（表3），與該菌株一樣對黃瓜霜霉病表現(xiàn)出較好的防效［17］。

2.3.2 粗蛋白對辣椒疫霉菌的抑菌效果 據(jù)報道，黃瓜霜霉病可能與疫霉分類地位相似，故本實驗選擇辣椒疫霉菌作為指示菌檢測提取的粗蛋白活性［19］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HS10粗蛋白可抑制辣椒疫霉菌絲生長，造成菌絲頂端生長異常，膨大扭曲、畸形，菌絲胞質(zhì)分布不均勻，營養(yǎng)吸收障礙，生長受抑制，由白色變黃色（圖1）。

圖1 HS10粗蛋白對辣椒疫霉病菌菌絲生長的影響Fig.1 Effect of HS10 crude protein on the growth of P.capsici mycelium

2.4 HS10菌株對植物防御酶活性的影響

HS10菌株噴霧預(yù)處理黃瓜葉片后，發(fā)現(xiàn)PAL和POD活性變化趨勢為“上升-下降-上升”。PAL活性表現(xiàn)為在0～12 h高于對照，48 h達到峰值（圖2A），POD活性表現(xiàn)為0～6 h高于對照，48 h達到峰值（圖2B）。可見，該菌株預(yù)處理葉片，也提前引發(fā)植物防御酶活性的增加。

3 討論

前期，我們從黃瓜健康根圍土中分離篩選到一株有效生防地衣芽孢桿菌HS10，通過檢測發(fā)現(xiàn)其對多種病原菌均有平板頡頏效果；在對與黃瓜霜霉病菌分類地位較接近的其他病害如荔枝霜疫病菌引起的霜疫病防效分析中，我們同樣發(fā)現(xiàn)該菌株對田間或采后果實均表現(xiàn)生防效果，且該菌株的菌源VOCs同樣對霜疫病具有抑制效果［16］，初步說明該生防菌可作為較好的生防因子防治一類病害，特別是霜霉科病害。

圖2 HS10菌株對黃瓜葉片PAL、POD活性的影響Fig.2 Effects of HS10 strain on PAL and POD activity in cucumber leaf

近年來，從抗菌蛋白的角度解析生防芽孢桿菌的可能作用機制成為研究熱點，發(fā)現(xiàn)了不少新型抗菌蛋白。所涉及的生防菌株包括枯草芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和其他新型芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)抗菌蛋白大都具有抗菌譜廣、穩(wěn)定性良好等優(yōu)勢，蛋白大小不等、種類多樣，如枯草芽孢菌分離的41.9 ku抗菌蛋白（Bacisubin）具有凝集素活性和核糖核酸酶活性，對鏈格孢屬（Alternaria）真菌有較強的抑制作用［20］；蠟質(zhì)芽孢菌分離的30 ku蛋白為新型胞外幾丁質(zhì)酶［21］；解淀粉芽孢桿菌分離的50 ku抗廣譜真菌蛋白Baciamin可以抑制各種腫瘤的增殖，激活巨噬細胞的一氧化氮活性，并抑制HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）［22］；在蜜蜂體內(nèi)新型芽孢桿菌分離的一種35.615 ku鞭毛蛋白（flagellin），也具有抑菌活性［23］。同時，胞外脂肽類化合物也是重要的抑菌物［24］。在針對HS10粗蛋白的研究中，對黃瓜霜霉病的田間防效達到60.08%，隨后的研究中發(fā)現(xiàn)粗蛋白能夠造成菌絲頂端生長異常，膨大扭曲、畸形。推測HS10菌株可能通過胞外分泌物抑制病原菌的生長，是生防效果發(fā)揮的重要途徑之一，也為新型生物農(nóng)藥開發(fā)提供途徑。

生物激發(fā)因子能夠通過誘導(dǎo)細胞防衛(wèi)反應(yīng)抵抗病原菌侵?jǐn)_，包括活性氧的爆發(fā)，細胞壁的加厚，植保素的積累，以及防御酶活性的變化等［25-26］。PAL與酚類物質(zhì)、木質(zhì)素及植保素等植物抗病物質(zhì)的合成密切相關(guān)；POD可清除活性氧，并氧化酚類物質(zhì)為對病原菌具有毒害作用的醌類物質(zhì)，促進木質(zhì)素合成。本研究結(jié)果表明，用HS10處理后的黃瓜葉片中PAL和POD活性與對照相比發(fā)生了明顯變化，處理6 h內(nèi)，酶活性均高于對照，但峰值延遲，36～48 h才快速上升，對照則在6～12 h快速上升。可能原因為菌體處理后提前激活植物防御酶活性，隨著菌株定殖量的減少，酶活性降低，但之后定殖的菌體開始增殖，激活防御相關(guān)酶的活性。

4 結(jié)論

地衣芽孢桿菌HS10對稻瘟病菌、霜疫霉菌、辣椒疫霉菌表現(xiàn)較好平板頡頏作用，抑菌圈在10 mm以上；對與黃瓜霜霉病菌具有相似分類地位的荔枝霜疫菌及其引發(fā)的荔枝霜疫病表現(xiàn)出抑菌和防病效果；該菌株可通過胞外分泌蛋白抑制辣椒疫霉菌的菌絲生長，通過影響防病相關(guān)酶PAL和POD活性的改變達到防病的作用。在未來研究中，我們將進一步探討抗性相關(guān)基因的表達水平，對病原真菌菌絲生長形態(tài)和生長相關(guān)調(diào)控的影響機制，以及對葉圍或果實表面的微生物群落豐度的影響。