MMCA 技術分析廣西苗族婦女葉酸代謝通路關鍵酶基因MTHFR 677C>T、1298A>C 和MTRR 66A>G 的多態(tài)性

楊芳華 王捷 韋笑寶 石美蓮 羅世強 鐘鑫 嚴提珍（通訊作者）

（1 柳州市婦幼保健院婦女康復科 廣西 柳州 545001）

（2 融水苗族自治縣婦幼保健院 廣西 柳州 545300）

（3 柳州市婦幼保健院醫(yī)學遺傳科，柳州市出生缺陷預防與控制重點實驗室 廣西 柳州 545001）

出生缺陷嚴重危害人類的健康，其預防工作非常重要。葉酸代謝過程中亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因677C>T、1298A>C 和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）的基因66A>G 多態(tài)性與出生缺陷發(fā)生有密切關系[1]。葉酸多態(tài)性位點的分布存在地區(qū)和種族差異性。MTHFR 和MTRR 基因單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）的分型方法主要包括限制性片段長度多態(tài)性技術、Taqman-MGB 技術、焦磷酸測序技術等。多色探針熔解曲線法（multicolor melting curve analysis，MMCA）是近幾年來新建立的基因分型技術[2]，該技術已廣泛應用于單基因遺傳病基因突變檢測和多發(fā)疾病易感SNP 分型[3]。本研究以廣西苗族女性為研究對象，采用MMCA 法對 MTHFR 677C>T、1298A>C 和MTRR 66A>G 多態(tài)性位點進行基因分型，并與其它地區(qū)不同民族的遺傳分布特征進行比較。

1.對象與方法

1.1 對象

2019 年1 月—12 月在融水婦幼保健院進行婚育檢查的苗族婦女500 例，平均年齡23.05±5.82 歲。本研究經(jīng)柳州市婦幼保健院倫理委員會批準并征得被檢對象知情同意。采集口腔黏膜細胞應用MMCA 法進行檢測。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取和濃度測定

嚴格按照說明書采用柱式提取試劑盒提取樣本口腔黏膜細胞DNA，并檢測其質(zhì)量和濃度（ND-1000-UV-VIS 紫外/可見光掃描分光光度計）。

1.2.2 MMCA 法進行MTRR 和MTHFR 基因分型

利用“葉酸代謝相關基因多態(tài)性檢測試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法）”進行檢測，嚴格按照說明書進行操作。通過CFX96實時熒光PCR 儀進行檢測和結果分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用HaploView4.2 軟件對研究人群進行MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G 多態(tài)性位點的Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗。采用SPSS22.0 軟件對獲得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各地區(qū)各民族之間的基因型和等位基因型頻率的差異比較采用χ2檢驗。計量資料采用±s 表示，用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡分析

對廣西苗族女性MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G 三個SNP 位點分別進行平衡檢驗，經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗，三個SNP 位點的基因型頻率和基因頻率處于遺傳平衡狀態(tài)（χ2分別為0.005、0.002 和3.186，P 均＞0.05），表明本研究取樣是隨機的。

2.2 苗族女性MTHFR、MTRR 基因型和等位基因頻率分布情況

500 例廣西苗族女性MTHFR 677 CC、CT、TT 的分布頻率依次為：72.2%、25.6%、2.2%；MTHFR 1298 AA、AC、CC 的基因型頻率分別為54.4%、38.6%和7.0%；MTRR 66 AA、AG、GG 的分布頻率依次為49.2%、43.4%和7.4%。MTHFR 677C>T 的C 和T 等位基因頻率分別為73.3%和26.7%，MTHFR 1298A>C 的A 和C 等位基因的頻率分別73.7%和26.3%，MTRR 66A>G 的A 和C 等位基因頻率分別為70.9%和29.1%。

2.3 不同民族女性MTHFR、MTRR 基因多態(tài)性位點基因型和等位基因頻率比較

不同民族女性MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G 基因型及等位基因頻率比較見表1 ～3。廣西苗族MTHFR 677C>T 的基因型頻率與海南黎族[4]、新疆哈薩克族[5]、貴州土家族[6]、貴州苗族[6]、湖南土家族[7]、云南阿昌族[8]、云南傈僳族[8]、西藏藏族[9]女性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。廣西苗族677T 等位基因頻率與海南黎族、貴州土家族、貴州苗族、湖南土家族女性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），與新疆哈薩克族、云南阿昌族、云南傈僳族、西藏藏族比較差異無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。廣西苗族MTHFR 1298A>C 的基因型頻率與貴州土家族、貴州苗族、海南黎族、湖南土家族女性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05），而與新疆哈薩克族、云南阿昌族、西藏藏族比較差異無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。廣西苗族1298C 等位基因頻率與貴州土家族、貴州苗族、湖南土家族、云南傈僳族女性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05），與海南黎族、新疆哈薩克族、云南阿昌族、西藏藏族差異無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。廣西苗族MTRR 66A>G 的基因型頻率與海南黎族、新疆哈薩克族、貴州土家族、貴州苗族、西藏藏族女性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），而與湖南土家族、云南阿昌族、云南傈僳族比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。廣西苗族66G等位基因頻率與海南黎族、新疆哈薩克族、貴州土家族、貴州苗族、西藏藏族女性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），與湖南土家族、云南阿昌族、云南傈僳族比較差異無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。

表1 不同民族女性MTHFR 677C>T 基因型及等位基因頻率比較（%）

表2 不同民族女性MTHFR 1298A>C 基因型及等位基因頻率比較（%）

表3 不同民族女性MTRR 66A>G 基因型及等位基因頻率比較（%）

3.討論

2019 年柳州市圍產(chǎn)兒出生缺陷總發(fā)生率為14.00‰，主要類型包括先天性心臟病、多指（多趾）、外耳其他畸形、尿道下裂、并指（并趾）、唇裂、小耳、腭裂、馬蹄內(nèi)翻足、直腸肛門閉鎖、胎兒水腫綜合征等。研究表明引起出生缺陷發(fā)生的因素主要包括環(huán)境因素、遺傳因素和營養(yǎng)因素，隨著分子遺傳學技術的發(fā)展，遺傳因素的作用顯得越來越重要。葉酸和同型半胱氨酸代謝途徑的關鍵酶是MTHFR 和MTRR，其基因多態(tài)性與出生缺陷關系密切[1]，此外，這些多態(tài)性位點在不同地區(qū)分布存在差異，與所在民族居住地的氣候、環(huán)境、飲食習慣等因素相關[7]。

本研究對廣西柳州500 例苗族女性進行了MTHFR 677C>T、MTHFR 1298A>C、MTRR 66A>G位點分布情況調(diào)查，并與海南黎族[4]、新疆哈薩克族[5]、貴州土家族[6]、貴州苗族[6]、湖南土家族[7]、云南阿昌族[8]、云南傈僳族[8]、西藏藏族[9]數(shù)據(jù)進行了比較。本文發(fā)現(xiàn)廣西苗族677T 等位基因頻率高于海南黎族、云南阿昌族、新疆哈薩克族，低于貴州土家族、貴州苗族、湖南土家族、云南傈僳族，不完全遵循由南到北呈現(xiàn)遞增趨勢，與國內(nèi)已報道的其它地區(qū)和民族情況不太一致[6]，與部分亞洲國家（如約旦和印度）MTHFR 基因677T 等位基因頻率分布規(guī)律存在差異[6]，提示這種分布規(guī)律的原因可能是由紫外線照射強度和飲食習慣引發(fā)[6]。MTRR 基因66G 等位基因在少數(shù)民族中呈現(xiàn)由南向北逐漸遞減的趨勢，這一結果與國內(nèi)學者對部分地區(qū)漢族人所做的研究結果相似[6]?；诓煌貐^(qū)、不同民族的遺傳特征差異[10]，在制定相關孕期保健方案時，我們需要人性化指導用藥。通過開展廣西苗族女性 MTHFR 和MTRR 基因多態(tài)性的分子流行病學研究，了解本地區(qū)少數(shù)民族人群的遺傳特征，將為當?shù)爻錾毕菀患夘A防和公共衛(wèi)生政策提供科學依據(jù)。