骨不連患者外周血miRNA 的表達(dá)及其臨床意義

孔超 陳石玉 羅建光 王煒 戚春潮

（寧波市鎮(zhèn)海區(qū)人民醫(yī)院骨科 浙江 寧波 315202）

隨著國(guó)內(nèi)外生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展，miRNA 作為分子生物與生物信息學(xué)領(lǐng)域中的新秀，被迅速應(yīng)用在各類疾病的基礎(chǔ)研究、診治與新型藥品開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域[1]。多種miRNA 被證實(shí)與骨折愈合有密切關(guān)聯(lián)[2]。但目前國(guó)內(nèi)外均將研究重點(diǎn)放在局部組織活檢，而無(wú)創(chuàng)的早期檢測(cè)手段仍然欠缺。因此，迫切需要一種無(wú)創(chuàng)快捷的檢測(cè)方法輔助診斷骨不連，提高患者的早期臨床干預(yù)率，減少骨不連的發(fā)生發(fā)展。基于此，本研究為了進(jìn)一步分析骨不連患者外周血miRNA 的表達(dá)及其臨床意義，就寧波第七醫(yī)院各15 例健康人組、按期愈合組、骨不連組患者的病歷資料展開(kāi)對(duì)比分析，報(bào)告如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

依據(jù)隨機(jī)對(duì)照雙盲實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，收集我院2015 年6 月—2018 年1 月30 例骨折患者，按骨折愈合程度分為按期愈合組和骨不連組兩組，每組各15 例。選擇同期健康體檢人員15 名作為健康人組。健康人組：體檢中心采血標(biāo)本，排除骨與軟組織損傷患者、器質(zhì)性疾病患者、腫瘤及內(nèi)分泌代謝疾病患者，其中男8 例，女7 例，年齡19 ～54 歲，平均（36.3±10.5）歲。按期愈合組：取骨科脛腓骨中下1/3 骨折，符合手術(shù)指征并經(jīng)切開(kāi)復(fù)位內(nèi)固定手術(shù)治療，術(shù)后3 月X 線骨折按期愈合患者；排除腦外傷患者、骨延遲愈合患者（骨折愈合時(shí)間≥3 月且≤8 月）、合并器質(zhì)性疾病或腫瘤、全身內(nèi)分泌代謝疾病患者，其中男9 例，女6 例，年齡19 ～52 歲，平均（36.1±10.6）歲。骨不連組：取骨科脛腓骨中下1/3 骨折，符合手術(shù)指征并經(jīng)切開(kāi)復(fù)位內(nèi)固定手術(shù)治療，而術(shù)后3 月患者骨折未愈合，且延長(zhǎng)觀察期至8 個(gè)月仍未愈合患者；排除腦外傷患者、骨延遲愈合患者（骨折愈合時(shí)間≥3 月且≤8 月）、合并器質(zhì)性疾病或腫瘤、全身內(nèi)分泌代謝疾病患者，其中男8 例，女7例，年齡19 ～53 歲，平均（36.4±10.4）歲。按期愈合組、骨不連組患者均經(jīng)X 線、CT 進(jìn)行確診。三組受試者的性別、年齡對(duì)比，均P ＞0.05。三組受試者均對(duì)研究?jī)?nèi)容知曉，并簽署知情同意書。

1.2 方法

分別提取三組受試者的外周血sRNA 并進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)。健康人組采體檢中心體檢血，按期愈合組、骨不連組患者采傷時(shí)血及術(shù)后3 天、10 天、1 月、3 月、5 月、8 月血。標(biāo)本液氮冷藏轉(zhuǎn)運(yùn)，及時(shí)Trizol 法提取總sRNA，RT-PCR 法檢測(cè)8 種目標(biāo)miRNA 表達(dá)量，包括miR-140、-654-5p、-378、-29、-203、-221、-9、-30b。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)比三組受試者各時(shí)段的外周血miRNA 檢測(cè)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

按期愈合組與骨不連組患者傷時(shí)的8 種目標(biāo)miRNA 表達(dá)量與健康人組對(duì)比，均差異顯著（P ＜0.05）。按期愈合組與骨不連組傷時(shí)、術(shù)后3 天、10 天的8 種目標(biāo)miRNA 表達(dá)量對(duì)比，均P ＞0.05。骨不連組患者術(shù)后1 月、3 月、5 月、8 月miR-140、-654-5p 表達(dá)量明顯高于同時(shí)段按期愈合組，均差異顯著（P ＜0.05）；而骨不連組患者術(shù)后1 月、3 月、5 月、8 月miR-378、-29、-203、-221、-9、30b 表達(dá)量顯著低于同時(shí)段按期愈合組（均P ＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 三組受試者各時(shí)段的外周血miRNA 檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

3.討論

骨不連是一種嚴(yán)重的骨折并發(fā)癥，在四肢長(zhǎng)骨骨折中的發(fā)生率高達(dá)5%～10%[3]。骨不連一旦發(fā)生，常規(guī)保守治療通常無(wú)法治愈，多需通過(guò)再次手術(shù)結(jié)合內(nèi)固定治療。骨不連臨床缺乏有效手段進(jìn)行預(yù)測(cè)，其為社會(huì)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失及醫(yī)療資源消耗。通過(guò)對(duì)骨不連早期預(yù)測(cè)進(jìn)行研究，篩選早期觀測(cè)指標(biāo)，開(kāi)發(fā)早期監(jiān)測(cè)產(chǎn)品，將有助于骨不連的早期診斷，使臨床治療具有更好的針對(duì)性及敏感性，預(yù)防骨不連的發(fā)生或持續(xù)進(jìn)展，并進(jìn)一步減少醫(yī)療資源浪費(fèi)[4-5]。

本研究結(jié)果顯示，按期愈合組與骨不連組患者傷時(shí)的外周血miRNA 表達(dá)量與健康人組對(duì)比存在明顯差異，提示脛腓骨中下1/3 骨折會(huì)導(dǎo)致miRNA 的異常表達(dá)；研究結(jié)果還顯示，按期愈合組與骨不連患者術(shù)后1、3、5、8 個(gè)月的miRNA 表達(dá)量存在明顯差異，骨不連組miR-140、-654-5p 存在高表達(dá)，而miR-378、-29、-203、-221、-9、30b 呈現(xiàn)低表達(dá)，由此提示，骨不連會(huì)導(dǎo)致外周血多種miRNA 的異常表達(dá)，且術(shù)后1 月即可發(fā)現(xiàn)與正常骨折愈合患者的差異性表達(dá)，我們推斷這8 種目標(biāo)miRNA 作為多種蛋白的上游調(diào)控因子，可抑制或促進(jìn)骨折愈合的兩個(gè)重要過(guò)程：成骨及血管生成，從而影響骨折的愈合。

綜上所述，骨不連患者外周血miRNA 存在異常表達(dá)，臨床檢測(cè)外周血miRNA 分子標(biāo)志物可為骨不連早期診斷提供參考依據(jù)，從而早期利用各種手段干預(yù)骨不連的進(jìn)展，在提高骨折延遲愈合患者的預(yù)后方面具有重要意義。