苯肽胺酸原藥和可溶液劑高效液相色譜分析方法

孟 燦，馬杜康，原萬玲，趙鵬躍，黃啟良

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

苯肽胺酸(phthalamic acid)，化學(xué)名稱N-苯基鄰苯二甲酸單酰胺，CAS號(hào)4727-29-1，是一種白色針狀晶體，微溶水、氯仿、四氯甲烷等，溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑[1]。原藥外觀為淡黃色或白色粉狀固體。研究表明，苯肽胺酸能夠增強(qiáng)雌花柱頭的活性，促進(jìn)作物開花和結(jié)果，尤其是在果樹上使用具有較好的效果。在溫室或大田狀態(tài)下，苯肽胺酸可以誘導(dǎo)作物產(chǎn)生抗逆性，增強(qiáng)對(duì)逆境的適應(yīng)性[2]。苯肽胺酸1982年創(chuàng)制于匈牙利Neviki化工工業(yè)研究所，2018年在我國以植物生長調(diào)節(jié)劑獲得正式登記。開展苯肽胺酸農(nóng)藥產(chǎn)品中有效成分定性定量分析方法對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)控和行業(yè)監(jiān)管具有重要的意義。

有文獻(xiàn)報(bào)道了苯肽胺酸含量測定的紫外-可見分光光度法，該方法線性相關(guān)性好，重復(fù)性和準(zhǔn)確性高[3]。吳厚斌等以鄰苯二甲酸二環(huán)己酯為內(nèi)標(biāo)物，建立了苯肽胺酸原藥的氣相色譜分析方法，該方法具有較好的線性、精密度和準(zhǔn)確度[4]。劉同金等采用氣相色譜建立了苯肽胺酸在小麥及土壤中的殘留分析方法[5]。秦旭等采用高效液相色譜法測定了棉花中苯肽胺酸的殘留[6]。韋思華等建立了生物樣品大鼠血樣和組織樣本中苯肽胺酸含量測定的高效液相色譜分析方法[7]。目前關(guān)于苯肽胺酸原藥和制劑產(chǎn)品的高效液相色譜分析方法尚未見報(bào)道。本文建立了在同一液相色譜條件下測定苯肽胺酸原藥和可溶液劑的方法，為苯肽胺酸農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1260-DAD 高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器)；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18不銹鋼柱(250mm×4.6mm, 5μm)；KQ3200B超聲波清洗器；有機(jī)過濾器(微膜孔徑0.45μm)。

甲醇(色譜純)；二次蒸餾水；磷酸(分析純)；苯肽胺酸標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.90%)；98%苯肽胺酸原藥；20%苯肽胺酸可溶液劑。

1.2 液相色譜操作條件 流動(dòng)相：甲醇+0.1%磷酸水(體積比50:50)；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm；進(jìn)樣體積：5μL；保留時(shí)間：苯肽胺酸約6.0min。

上述液相色譜操作條件是典型的操作參數(shù)，可以根據(jù)不同儀器特點(diǎn)和溫度條件，對(duì)給定的操作參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以獲得最佳效果。典型的苯肽胺酸標(biāo)準(zhǔn)品、98%苯肽胺酸原藥和20%苯肽胺酸可溶液劑樣品高效液相色譜圖(圖1～3)。

1.3 測定步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取0.025g(精確至0.000 01g)苯肽胺酸標(biāo)準(zhǔn)品于25mL容量瓶中，加入10mL甲醇，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。

1.3.2 試樣溶液的配制 分別稱取98%苯肽胺酸原藥試樣0.025g、20%苯肽胺酸可溶液劑試樣0.1g(精確至0.000 01g)于100mL容量瓶中，加入20mL甲醇，超聲波振蕩5min，冷卻至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾待測。

1.3.3 測定 在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針苯肽胺酸峰面積相對(duì)變化<1.2%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定。

1.3.4 計(jì)算 將測得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中苯肽胺酸峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中苯肽胺酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

A2——試樣溶液中苯肽胺酸峰面積的平均值；

m1——苯肽胺酸標(biāo)樣的質(zhì)量， g；

A1——標(biāo)樣溶液中苯肽胺酸峰面積的平均值；

m2——試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相的選擇 由于98%苯肽胺酸原藥中有一定的雜質(zhì)干擾，為使有效成分得到良好的分離效果，并且峰形尖銳，保留時(shí)間適中，根據(jù)苯肽胺酸物化性質(zhì)和溶劑的紫外吸收波長，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品，并以甲醇和0.1%磷酸水作為流動(dòng)相，并按不同的比例在色譜柱上進(jìn)行條件優(yōu)化。隨著甲醇比例的增加，保留時(shí)間減小，當(dāng)甲醇與0.1%磷酸水體積比為60:40時(shí)，雜質(zhì)峰干擾苯肽胺酸，峰純度達(dá)不到試驗(yàn)要求，最終選擇甲醇+ 0.1%磷酸水(體積比50:50)作為流動(dòng)相，流速1.0mL/min。該條件下，苯肽胺酸色譜峰峰形較好，與雜質(zhì)能完全分離，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，并且分析時(shí)間較短，提高了工作效率。

2.2 檢測波長的選擇 利用紫外-可見檢測器對(duì)苯肽胺酸溶液在210～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。苯肽胺酸的紫外光譜圖(圖4)，從圖中可以看到苯肽胺酸的最大吸收波長約235nm。然而，在該波長處檢測苯肽胺酸有一定的干擾，峰純度不能達(dá)到要求，而在波長254nm處干擾較少，峰純度達(dá)到990以上，能夠滿足分析的要求，故將檢測波長確定為254nm。

2.3 分析方法的特異性 本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度進(jìn)行苯肽胺酸高效液相色譜分析方法特異性鑒別。結(jié)果表明，苯肽胺酸標(biāo)樣、98%苯肽胺酸原藥和20%苯肽胺酸可溶液劑中的苯肽胺酸HPLC-DAD峰純度均>990，有效成分處無其它物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

2.4 分析方法的線性關(guān)系 按1.3.1標(biāo)準(zhǔn)品的配制方法配制標(biāo)樣溶液，用甲醇以1:1的比例梯度稀釋4次，獲得5個(gè)濃度的有效成分線性相關(guān)溶液。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，分別進(jìn)同樣體積的標(biāo)樣溶液，進(jìn)行測定，取2次測定的平均結(jié)果。以苯肽胺酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從圖5可以看出，苯肽胺酸質(zhì)量濃度在62.69～1 003.00mg/L之間(進(jìn)樣體積5μL)，與相應(yīng)的苯肽胺酸峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=10.892x-35.057，相關(guān)系數(shù)(R2)為1.000 0，可以滿足定量分析要求。

2.5 分析方法的精密度 從同一樣品中稱取5個(gè)試樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，測得98%苯肽胺酸原藥和20%苯肽胺酸可溶液劑的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.35%和0.11%(表1)。

表1 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

98%苯肽胺酸原藥中苯肽胺酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.34(其中C為樣品中有效成分含量，以小數(shù)計(jì))，表明有效成分分析方法精密度的測定結(jié)果符合要求。

20%苯肽胺酸可溶液劑中苯肽胺酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.50，小于修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.69，表明有效成分分析方法精密度的測定結(jié)果符合要求。

2.6 可溶液劑分析方法的準(zhǔn)確度 分別稱取5個(gè)已知含量的可溶液劑試樣于100mL容量瓶中，加入1.3.1中配制的苯肽胺酸標(biāo)樣溶液4mL，用甲醇超聲溶解，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻。苯肽胺酸的回收率按式(2)計(jì)算

(2)

式中：

R——回收率，%；

a——測定量，mg；

b——所稱原藥樣品中待測組分量，mg；

c——理論加入量，mg。

經(jīng)測定，20%苯肽胺酸可溶液劑的平均回收率為100.38%，試驗(yàn)結(jié)果(表2)，表明有效成分分析方法準(zhǔn)確度的測定結(jié)果符合要求。

表2 苯肽胺酸可溶液劑分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

結(jié)果表明，本方法可用于98%苯肽胺酸原藥和20%苯肽胺酸可溶液劑定量分析，具有良好的分離效果，線性關(guān)系良好，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，并且操作簡便、快速，是進(jìn)行苯肽胺酸農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量檢測較理想的分析方法。