防治火龍果炭疽病安全用藥技術(shù)初探

張 怡，沈迎春

( 江蘇省農(nóng)藥總站，江蘇 南京 210036)

火龍果是一種風(fēng)味鮮美的特色經(jīng)濟作物，營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者喜愛。自20世紀(jì)90年代初在我國臺灣試種火龍果，火龍果產(chǎn)業(yè)逐漸發(fā)展，目前我國火龍果種植面積約有50～60萬畝，主要集中在廣西、廣東、海南、云南、貴州等地[1]。近年來，農(nóng)村種植業(yè)結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，華東地區(qū)溫室火龍果栽培逐步興起，溫室火龍果定植后壽命可達(dá)50年以上，盛果期每667m2產(chǎn)量可達(dá)400～500kg[2]，按照市場價格30元/kg計算，效益十分可觀，備受種植戶青睞。

火龍果在溫暖潮濕的條件下，肉質(zhì)莖易被盤圓孢屬(Colletotrichungloeosporioides(PenZ)真菌感染形成炭疽病，染病初期產(chǎn)生大量紅色病斑，隨著病情的擴散，病斑擴大并逐步連在一起，造成火龍果莖稈表面組織松弛，火龍果果實前期感染炭疽病不會表現(xiàn)癥狀，等生長成熟后病癥逐步顯現(xiàn)，果實出現(xiàn)水漬狀的病斑[2-4]?；瘕埞N植面積的擴大，為其病害的大流行提供了條件和場所，陳圓等[5]在2014～2015對海南火龍果主產(chǎn)區(qū)調(diào)研發(fā)現(xiàn)火龍果炭疽病從幼苗到果實成熟都可以發(fā)病，尤其危害果實可直接影響外觀和品質(zhì)，從而影響銷售。新修訂的《農(nóng)藥管理條例》規(guī)定了農(nóng)藥使用者應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照農(nóng)藥的標(biāo)簽、標(biāo)注的使用范圍、使用方法和劑量、使用技術(shù)要求和注意事項，不得擴大使用范圍、加大用藥劑量或者改變使用方法，而目前火龍果炭疽病并無登記藥劑可用[6-10]，探索火龍果炭疽病防治技術(shù)，建立應(yīng)急防治藥劑數(shù)據(jù)庫，確保農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全勢在必行。

本研究通過田間藥效試驗，研究嘧菌酯、咪鮮胺對火龍果炭疽病的防治效果，探究炭疽病防治應(yīng)用技術(shù)，并對選用農(nóng)藥進(jìn)行殘留驗證，為果農(nóng)防治炭疽病科學(xué)用藥提供數(shù)據(jù)支撐和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試靶標(biāo) 火龍果炭疽病(Gloeosporiumsp)。

1.1.2 供試藥劑 25%咪鮮胺水乳劑、250g/L嘧菌酯懸浮劑。

1.2 儀器設(shè)備 梅特勒AB135-S電子天平(精確度0.000 1 g)、試管、移液槍、JN-16C型背包式噴霧器等。

1.3 試驗方法

1.3.1 田間藥效試驗 田間試驗于2017年分別在鎮(zhèn)江和上海的火龍果溫室內(nèi)進(jìn)行。各試驗地供試作物情況、靶標(biāo)發(fā)生情況、施藥日期如(表1)。施藥劑量如(表2)，葉面噴霧處理，施藥液量1 000L/hm2。鎮(zhèn)江于火龍果炭疽病發(fā)病初期，均勻噴霧1次，間隔10～16d再噴1次，共噴霧2次；上海1次用藥后，隔日用培養(yǎng)好的西瓜炭疽病菌種接種后悶棚2d，后按常規(guī)管理，第1次用藥時火龍果炭疽病未發(fā)生，間隔7d再噴霧1次，共噴霧2次。末次藥后10d調(diào)查防效。試驗參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則第98部分《殺菌劑防治芒果炭疽病藥效試驗》執(zhí)行。

表1 田間管理措施

表2 供試藥劑施藥劑量設(shè)計

1.3.2 殘留試驗 殘留試驗于2017年在江蘇、上海、廣西進(jìn)行。試驗作物品種蜜寶(江蘇)、玫瑰紅(上海)、蓮花8號(廣西)。試驗按照NY/T788-2004“農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則”的要求進(jìn)行，分為動態(tài)消解試驗和最終殘留試驗。每處理重復(fù)3次，隨機區(qū)組設(shè)計，每小區(qū)面積30m2。

消解動態(tài)試驗：施藥時選擇葉片生長盛期的火龍果葉片，施藥應(yīng)保證用于動態(tài)試驗的芋株均勻著藥。施藥劑量為田間藥效試驗最高劑量的1.5倍，噴霧后2 h、1、2、3、5、7、14、21、28 d采集火龍果莖葉樣品。每次每小區(qū)采集≥2kg生長正常的火龍果樣本，另設(shè)清水空白對照。處理間設(shè)保護間隔區(qū)。

最終殘留試驗：按照供試藥劑田間藥效試驗推薦劑量和推薦劑量1.5倍2個劑量于火龍果葉斑病發(fā)病期施藥處理，施藥次數(shù)為2次和3次，對照區(qū)不施藥。在末次施藥后7 、14 和21d分別采樣。另設(shè)空白對照，處理間設(shè)保護帶。

1.4 樣品采集 殘留試驗的田間樣本在采集后，立即制備成實驗室樣品，放入冰柜中冷凍(4 h以內(nèi))。

火龍果動態(tài)樣品的采集：采用棋盤式分布采集10株上的葉片，每株按照內(nèi)、外、中采集，每小區(qū)采葉量≥2kg，充分混勻后，用四分法縮分，取150g裝入封口容器中，容器內(nèi)外各加上標(biāo)簽，保存在-20℃冰箱中待測。

最終殘留火龍果樣品的采集：于果實成熟期，每小區(qū)按隨機取樣法取火龍果，用毛刷和干布去除泥土及其他黏附物。樣品采集量至少為6～12個個體，且≥2kg，將火龍果充分混勻后，用四分法縮分，取150g裝入封口容器中，容器內(nèi)外各加上標(biāo)簽，保存在-20℃冰箱中待測。

1.5 分析測定

1.5.1 咪鮮胺 樣品(果實)經(jīng)丙酮機械振蕩提取，上清液濃縮近干，加入吡啶鹽酸鹽，在250℃沙浴鍋中衍生化后，用石油醚萃取，取上清，濃縮至干，正己烷定容，待測。

色譜柱：DB-1701 (30m×0.32mm×0.25μm)；進(jìn)樣口240℃；檢測器300℃；柱溫80℃，保持1min，以30℃/min升至160℃，保持2min，以35℃/min升至245℃，保持2min；

總流量：29.4mL/min，尾吹2.5mL/min，分流比：10.0；進(jìn)樣量：2.0μL。

咪鮮胺標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取0.010 1g的三氯苯酚標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 000mg/L)。用正己烷逐級稀釋成濃度為0.052、0.26、0.52、2.6、5.2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別對應(yīng)咪鮮胺的濃度為0.1、0.5、1、5、10ppm。在上述色譜操作條件下，分別進(jìn)樣2μL。測定三氯苯酚進(jìn)樣量與峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好。標(biāo)樣線性方程為：Y=239.2891X-3395.022 5，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.999 0；其中Y為三氯苯酚峰面積，X為進(jìn)樣濃度?？梢姡缺椒釉?.052～5.2 mg/L范圍內(nèi)，對應(yīng)咪鮮胺的濃度為0.1～10ppm，濃度與色譜峰面積呈顯著的線性關(guān)系。

1.5.2 嘧菌酯 樣品經(jīng)乙腈機械振蕩提取，勻漿2min，加入Nacl(2.0g)離心，吸取上清液過0.22m的濾膜，UPLC-MS/MS測定。

準(zhǔn)確稱取樣品5.0g，放入具塞三角瓶中。加入25 mL乙腈，機械振蕩1h，靜置10min后加入2.0g的Nacl，在高速分散機中以1 000r/min勻漿2min，轉(zhuǎn)速10 000r/min下離心10min，收集上清液，待凈化。將C18固相萃取柱分別用1mL乙腈、1mL水和1mL的分析液與條件化，棄去流出液，再加入1.5mL的分析液，并用5mL的試管收集，過0.22mm濾膜，上機。

色譜柱：Agilent Eclipse plus C18100×2.1mm, 3.5m，柱溫：40℃，流動相：A: 2/98=水/甲醇(V/V)+0.05%甲酸+5mmol的乙酸銨溶液 B:甲醇+0.05%甲酸，流動相采用梯度洗脫, 流速：0.2mL/min，進(jìn)樣量：5μL。電離方式：ESI+，毛細(xì)管電壓：3.0kv，離子源溫度：150℃，錐孔反吹氣流量：50L/Hr，脫溶劑氣溫度：400℃，脫溶劑氣流量：800L/Hr，監(jiān)測模式：MRM模式

嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取0.010 1g的嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 000mg/L)。用丙酮逐級稀釋成濃度為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述色譜操作條件下，分別進(jìn)樣5μL。測定嘧菌酯進(jìn)樣量與峰面積作標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好。標(biāo)樣線性方程為：Y=868 565X+7 543.7，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.998；其中Y為嘧菌酯峰面積，X為進(jìn)樣濃度?？梢?，嘧菌酯在0.01～0.2mg/L范圍內(nèi)，濃度與色譜峰面積呈顯著的線性關(guān)系，可滿足定量分析的需要。

1.5 計算方法 病情指數(shù)(葉)=[∑(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)] ×100

a—轉(zhuǎn)化系數(shù)，咪鮮胺為1.906；嘧菌酯為1

R—樣品中的農(nóng)藥含量，mg/kg

H(A)—樣品峰面積

ES—標(biāo)樣濃度，mg/kg

V—定容體積，mL

m—稱樣量

國家估算每日攝入量(NEDI)

根據(jù)規(guī)范殘留試驗中值(STMR/STMR-P)計算或最大殘留限量(MRL)計算某種農(nóng)藥國家估算每日攝入量(NEDI或TMDI)，計算NEDI時，如果沒有合適的STMR或STMR-P，可以使用相應(yīng)的MRL，應(yīng)注明是使用中值和限量值混合評估的結(jié)果。

NEDI =∑[STMRi(STMR-Pi)× Fi)]

STMRi—農(nóng)藥在某一食品中的規(guī)范殘留試驗中值；

STMR-Pi —用加工因子校正的規(guī)范殘留試驗中值；

Fi—一般人群某一食品的消費量。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間藥效試驗結(jié)果 鎮(zhèn)江、上海兩地施藥后目測觀察，供試藥劑各用量對火龍果無不良影響，作物生長正常。田間藥效試驗結(jié)果表明，25%咪鮮胺水乳劑和250g/L嘧菌酯懸浮劑對火龍果炭疽病具有較好的防效，兩地清水對照炭疽病病指分別為14.7和26.1，發(fā)生程度中等，咪鮮胺和嘧菌酯可以有效控制火龍果炭疽病危害。2種藥劑對火龍果炭疽病的防治效果隨著劑量增加而上升。

施用25%咪鮮胺水乳劑125～250g/hm2，末次藥后10d防效在73.4%～88.3%之間，上海試驗區(qū)咪鮮胺效果略好于鎮(zhèn)江試驗區(qū)，施用250g/L嘧菌酯懸浮劑100～200g/hm2，末次藥后10d防效在62.0%～85.7%之間，總體而言，25%咪鮮胺水乳劑對火龍果炭疽病防效優(yōu)于250g/L嘧菌酯懸浮劑。

表3 田間藥效試驗結(jié)果

2.2 殘留試驗結(jié)果 試驗結(jié)果表明，咪鮮胺在江蘇、上海、廣西試驗地火龍果葉片中咪鮮胺的原始沉積量為0.256～0.303mg/kg，在上海和廣西試驗點的殘留試驗中咪鮮胺在火龍果葉片中的平均殘留量與施藥間隔天數(shù)成明顯的指數(shù)關(guān)系(圖1)，江蘇試驗點的殘留試驗中咪鮮胺在火龍果葉片樣品中的咪鮮胺消解極快，無法模擬消解動態(tài)方程。在上海、廣西試驗點火龍果葉片中的消解半衰期分別為6.54、4.20d。嘧菌酯在江蘇、上海、廣西消解動態(tài)(表4)，消解速度較快無法模擬動態(tài)曲線。

表4 250g/L嘧菌酯懸浮劑在火龍果葉片中的消解動態(tài)

續(xù)表

最終殘留試驗結(jié)果表明，于火龍果成熟期采樣檢測，江蘇、上海、廣西試驗地火龍果葉片中咪鮮胺的殘留量為<0.1～0.319mg/kg。嘧菌酯的殘留量分別為：江蘇為 <0.1～0.248mg/kg；上海為<0.1～0.229mg/kg；廣西南寧為均<0.1mg/kg。

2.3 膳食風(fēng)險評估 根據(jù)殘留試驗得出，咪鮮胺規(guī)范殘留試驗中值(STMR)為：0.1 mg/kg，最高殘留值(HR)為0.32 mg/kg；嘧菌酯規(guī)范殘留試驗中值(STMR)為：0.1mg/kg，最高殘留值(HR)為0.248mg/kg。(表6)結(jié)果顯示，結(jié)合我國農(nóng)藥登記情況和我國居民的人均膳食結(jié)構(gòu)，普通人群咪鮮胺的國家估算每日攝入量是0.581 3mg，占日允許攝入量的92.3%，嘧菌酯的國家估算每日攝入量是0.708 5mg，占日允許攝入量的5.6%，結(jié)果表明對一般人群健康不會產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險。

表5 殘留試驗結(jié)果匯總

表6 膳食評估風(fēng)險

3 討論

本研究中所涉及到的2種殺菌劑都是生產(chǎn)上使用廣泛的殺菌劑，各具特色。咪鮮胺為廣譜性殺菌劑，系抑制麥角甾醇生物合成，具有保護和鏟除作用，對多種作物子囊菌和半知菌病害有顯著防效。嘧菌酯是繼1996年巴斯夫開發(fā)了第一個甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑醚菌酯后，于1997年由捷利康公司(現(xiàn)先正達(dá))開發(fā)的，其比醚菌酯殺菌譜更廣，適用作物更廣泛，現(xiàn)在85個國家80余種作物上均有使用[11]。研究表明，咪鮮胺對火龍果炭疽病病菌有很好的室內(nèi)活性，其EC50為0.109 3mg/L，優(yōu)于苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇和多菌靈。陳育民等[12]研究表明，50%咪鮮胺可濕性粉劑1 500倍液2次藥后10d防效達(dá)83.4%，與本試驗防效接近，效果優(yōu)于噁霉靈、波爾多液、氨基寡糖素和嘧菌酯，3次藥后各藥劑對火龍果炭疽病防效無明顯提高?？刂苹瘕埞烤也楹€需在前期輔以物理防治，如及時清園、摘除病葉、臭氧防治等，張耀良等[13]研究臭氧水在火龍果病蟲害防治中的應(yīng)用效果，發(fā)現(xiàn)每15d噴施臭氧水6～15mg/L，可抑制炭疽病病害增長4%～13%，可作為防治火龍果炭疽病的輔助手段。

殘留試驗期間江蘇最高溫度36℃，最低溫度11℃，平均氣溫21.4℃，雨日44 d，總降水量428.8mm；上海試驗點試驗期間最高溫度40℃，最低氣溫24℃，雨日18d；廣西試驗點試驗期間最高氣溫35℃，最低氣溫24℃，雨日27日，降雨量235mm。光解、雨水沖洗和自然分解是農(nóng)藥在植物表層組織中的降解的主要影響因素，增長稀釋及農(nóng)藥遷移則促進(jìn)了內(nèi)部組織中農(nóng)藥的消解。作物品種對農(nóng)藥在火龍果中的降解影響不大。咪鮮胺、嘧菌酯在火龍果葉片中的消解速率差異較小，且消解較快，這可能與其自身理化性質(zhì)有關(guān)，在火龍果果實中殘留很少。膳食風(fēng)險評估結(jié)果表明25%咪鮮胺水乳劑250～375g/hm2和250g/L嘧菌酯懸浮劑200～300 g/hm2施藥2次對一般人群健康風(fēng)險可接受。

綜合田間防效、殘留試驗結(jié)果，咪鮮胺和嘧菌酯適用于防治火龍果炭疽病，要注意輪換使用，防止抗藥性的產(chǎn)生。