卵巢癌腹水減低自然殺傷細胞與腫瘤細胞相互作用

何思思 吳金枝 張大權 王彥哲 茍小霞（通訊作者）

（1 遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科 貴州 遵義 563003）

（2 遵義醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院放療中心 貴州 遵義 563003）

卵巢癌作為全球高發(fā)的女性腫瘤之一，因其高死亡率嚴重威脅人類生命安全。約三分之二患者在確診時已處于疾病晚期[1,2]。目前針對晚期卵巢癌主要治療手段包括腫瘤細胞減滅術輔以化療、放療等綜合治療，但卵巢癌具有腫瘤異質性、高轉移率、進展迅速等特征，且當前治療手段中缺乏有效的維持治療，大部分患者復發(fā)時腫瘤已獲得耐藥性[3,4]，最終導致治療效果不佳，值得重視的是，超過三分之一的卵巢癌患者在診斷時已合并伴有腹腔積液，這也可作為腫瘤細胞腹腔轉移的重要提示[5]。近年來研究證實，卵巢癌腹水與不良預后密切相關。作為腫瘤細胞“儲備庫”，腹水中免疫細胞和免疫調(diào)節(jié)因子同時參與促進腫瘤生長并抑制宿主免疫系統(tǒng)的過程[6]。轉化生長因子β（T G F-β 信號）調(diào)節(jié)與漿液性卵巢癌的轉移和存活不佳相關[7]。Puiffe ML 等報道了卵巢癌腹水促進腫瘤細胞增殖、侵襲轉移[8]。Goncharenko-Khaider N 發(fā)現(xiàn)卵巢癌腹水通過明顯增加腫瘤細胞Mcl-1 表達進一步通過ERK1/2-Elk-1 通路減弱TRAIL 誘導的細胞凋亡[9]。卵巢癌腹水中成分復雜，腫瘤細胞可能發(fā)生免疫逃逸。自然殺傷細胞（natural killer cell，簡稱NK）作為機體天然免疫的主要承擔者，主要通過抑制性殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（K I R）和活化性受體N K G2D 調(diào)節(jié)殺傷腫瘤作用，但目前對于卵巢癌腹水環(huán)境中N K 細胞殺傷功能及活化性受體狀態(tài)尚未明確。

1.材料與方法

1.1 收集本院婦科患者晚期卵巢癌腹水20 例。從健康志愿者抽取50ml 外周血液，利用淋巴細胞分離液進行梯度離心獲得單核細胞群；根據(jù)磁性細胞分選技術NK Cell Isolation Kit 將細胞重懸至細胞濃度為10×107/ml。將培養(yǎng)好的NK 細胞用PBS 清洗3 次，平均加入兩管10ml 玻璃管，在避光的條件下分別加入CD56 抗體，CD3 抗體，待20min 后用PBS 清洗兩次后，上機檢測。NK 細胞純化指標：流式細胞儀檢測指標：CD56+CD3 ≥95%。

1.2 分離出的NK 細胞使用特殊配置的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每兩天半量換液，培養(yǎng)7 天后鋪板利用。培養(yǎng)48h 條件：RPMI4.5g/ml葡萄糖2mM 谷氨酰胺，10%人血清PAA，200U/ml IL-2，10ng/ml IL-15。培養(yǎng)1 周后收取細胞，棄上清，PBS 反復清洗三次將收集的細胞作下一步檢測。

1.3 取患者腹水1500g，3min,離心兩次后將細胞至于100mm 圓皿體外培，10% FBS RPMI-1640 培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基。選取人卵巢癌細胞株SKVO3 傳代。調(diào)整細胞濃度為1×105個細胞/ml 傳代培養(yǎng)。過夜貼壁后更換離心后腹水作用72 小時后，再次傳代重復上述步驟。培養(yǎng)1 周后收取細胞，棄上清，PBS 反復清洗三次將收集的細胞作下一步檢測。

1.4 制作單細胞懸液置于2ml 圓底流式管中，離心，1500g，3min，用槍尖棄上清液，在流式管加入100ul PBS，輕柔重懸；加入PBS 1ml至流式管中，反復離心洗滌2次，棄去上清，輕柔重懸。流式細胞技術檢測腹水對NK 細胞受體、CD107a、IFN-γ 變化。

2.結果

結果表明，經(jīng)過磁珠分選N K 細胞純度達到85%以上且穩(wěn)定。通過卵巢癌腹水培養(yǎng)后，流式細胞術證實N K 細胞激活受體NKG2D 表達、IFN-γ 分泌及CD107a 水平受到明顯抑制。

通過對腹水培養(yǎng)后NK 細胞受體、CD107a 脫顆粒、IFN-γ水平檢測，進一步證實了卵巢癌腹水明顯降低NK 細胞NKG2D受體表達（圖1A），且IFN-γ 分泌、CD107a 表達水平降低，而對NKp44、NKp46 無影響（圖1B）。

3.討論

卵巢癌腹腔微環(huán)境中存在CD4+CD25+Treg，且其含量及免疫抑制功能較外周血PBMC 顯著增高，提示卵巢癌腹腔內(nèi)更易發(fā)生免疫逃逸作用[10]。其中自然殺傷細胞（natural killer cell，簡稱NK）作為機體天然免疫的主要承擔者，主要通過抑制性殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（KIR）和活化性受體NKG2D 調(diào)節(jié)殺傷腫瘤作用，但目前對于卵巢癌腹水環(huán)境中NK 細胞殺傷功能及活化性受體狀態(tài)尚未明確。

NK 細胞發(fā)揮細胞毒殺傷作用的方式是通過平衡激活性受體和抑制性受體的信號。NKG2D 受體家族與NK 細胞發(fā)揮激活功能密切相關。在NK 細胞，CD8+淋巴細胞和γδT 細胞表面，NKG2D受體均有表達。激活NKG2D 受體配體可特異性識別并殺傷腫瘤細胞。盡管自然殺傷細胞具有抗腫瘤作用，但卵巢癌腹水中NK 細胞殺傷機制是否得到有效激活尚未可知。

近來研究表明，給予外周血單個核細胞聯(lián)合白介素-2 腹腔注射NSG 卵巢癌小鼠模型，結果發(fā)現(xiàn)外周血與腹膜腔中NK 細胞明顯增殖，且NK 脫顆粒酶作用上調(diào)。這說明NK 細胞作為主要效應細胞在腹膜腔中發(fā)揮抗腫瘤作用。另一項研究證實體外擴增卵巢癌患者外周血來源及腹水來源的自然殺傷細胞對體原發(fā)性卵巢癌細胞和卵巢癌耐藥細胞株表現(xiàn)出明顯殺傷活性，這說明卵巢癌惡性腹水中的自然殺傷細胞在體外環(huán)境發(fā)揮抗腫瘤作用，但該研究未深入探究自然殺傷細胞在腹水環(huán)境中是否發(fā)揮殺傷功能。

更早期研究提示，卵巢癌腹水來源腫瘤細胞表達NK 相關的識別結構，但是對未受刺激的效應細胞的細胞溶解具有相對抗性目前研究并未對卵巢癌腹水影響腫瘤與自然殺傷細胞相互作用做更深一步探究，且國內(nèi)外從基礎研究角度對卵巢癌腹水誘導腫瘤細胞免疫逃逸及其機制研究尚少，開展這一研究對卵巢癌聯(lián)合治療策略研究具有重要意義。

本項目通過檢測腹水培養(yǎng)后腫瘤細胞與自然殺傷細胞發(fā)現(xiàn)，以NKG2D 受體及配體為主的交互作用明顯收到抑制，且NK 脫顆粒作用減低，殺傷活性明顯減低。研究證實卵巢癌腹水環(huán)境中NK 細胞受到抑制主要與受體配體相互作用有關。但本實驗為小樣本實驗，還需大樣本來進一步驗證。