豬USP18基因表達(dá)規(guī)律及其與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

周泉勇 萬明春 季華員 劉晨龍 方紹培 黃江南

摘要：【目的】明確泛素特異性蛋白酶18基因（USP18）在豬不同妊娠時期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)規(guī)律及其與雌激素和孕激素的關(guān)系，并分析其多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)性，為揭示USP18基因在豬妊娠過程中的作用機(jī)理提供參考依據(jù)。【方法】PCR擴(kuò)增豬USP18基因編碼區(qū)（CDS）序列及開展相關(guān)生物信息學(xué)分析，利用實時熒光定量PCR檢測USP18基因在梅山豬和大白豬妊娠15、26和50 d子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平，通過體外細(xì)胞試驗檢測分析雌二醇和孕酮聯(lián)合處理對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞USP18基因表達(dá)的影響，并采用PCR-RFLP和SPSS 19.0檢測豬USP18基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)性。【結(jié)果】豬USP18基因CDS序列為966 bp，共編碼322個氨基酸殘基，編碼蛋白分子量為37 kD，理論等電點（pI）為6.74;豬USP18氨基酸序列與牛USP18氨基酸序列的同源性為82%，二者的遺傳距離最近。USP18基因在妊娠15和26 d梅山豬和大白豬子宮內(nèi)膜中的相對表達(dá)量均明顯高于妊娠50 d，且在妊娠26和50 d，USP18基因在梅山豬子宮內(nèi)膜組織中的相對表達(dá)量顯著高于在大白豬子宮內(nèi)膜組織中的相對表達(dá)量（P<0.05，下同）。以10-10 mol/L雌二醇和10-8 mol/L孕酮聯(lián)合處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，USP18基因在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的相對表達(dá)量呈上調(diào)趨勢，且顯著高于激素處理前的相對表達(dá)量。在豬USP18基因CDS序列953 bp處存在1個SNP位點（T/G錯義突變），其不同基因型與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，在經(jīng)產(chǎn)母豬中，TG基因型母豬產(chǎn)活仔數(shù)最多，GG基因型母豬產(chǎn)活仔數(shù)最少，且差異顯著。【結(jié)論】豬USP18基因在附植期子宮內(nèi)膜中高水平表達(dá)，且在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)受雌激素和孕激素誘導(dǎo)，表明USP18基因在妊娠早期建立過程中發(fā)揮著重要作用。USP18基因在梅山豬和大白豬間的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致梅山豬產(chǎn)仔數(shù)高于大白豬的一個重要因素。

關(guān)鍵詞： 豬;USP18基因;子宮內(nèi)膜;上皮細(xì)胞;妊娠;激素

中圖分類號： S828.81? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）07-1714-07

Abstract：【Objective】The aim of study was to clarify the expression of porcine ubiquitin specific peptidase 18 gene（USP18） in Meishan pig and Yorkshire pig endometrium during different gestation stages， examine the relationship between its expression and estrogen and progesterone，analyze the association between USP18 gene polymorphism and li-tter size， and thus to provide important data for revealing the role of USP18 gene in the process of pregnancy. 【Method】The PCR was used to amplify protein coding region（CDS） of USP18 gene， and bioinformatics analysis was conducted. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the USP18 gene expression level in endometrium of Meishan pig and Yorkshire pig on 15 d， 26 d and 50 d of pregnancy. The cell transfection technology was used to detected the effect of estradiol and progesterone on the USP18 gene expression in endometrial epithelial cells. The polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP） and SPSS 19.0 software were used to analyze the association between the gene polymorphism of USP18 and reproductive traits. 【Result】The CDS sequence of pig USP18 gene was 966 bp. It encoded 322 amino acids， and the molecular weight and the isoelectric point（pI） were 37 kD and 6.74 respectively. Amino acid sequence of USP18 protein had 82% similarity with cattle， and their genetic distance was the nearest.? The expression level of USP18 gene on day 15 and day 26 of pregnancy were higher compared with day 50 of pregnancy both in Meishan and Yorkshire endometriums， and the expression in Meishan pig endometrium was significantly higher than in Yorkshire pig endometriums both on day 26 and day 50 of pregnancy（P<0.05， the same below）. Moreover， treating with 10-10 mol/L estradiol and 10-8 mol/L progesterone in endometrial epithelial cells， the expression of USP18 was induced and was significantly higher than that before hormone treatment. Gene polymorphism analysis indica-ted that USP18 CDS sequence had a SNP site（T/G missense mutation） at 953 bp. The association analysis between various genotypes and litter size traits indicated that among multiparous sows， TG genotpye sows had the largest litter size and GG genotpye sows had the smallest litter size， and with significant difference. 【Conclusion】USP18 gene has high level expression in endometriums during implantation and is induced by estrogen and progesterone. This results indicates that USP18 may play important roles in the establishment of early pregnancy. And the differential expression in endometrium between Meishan pig and Yorkshire pig may be an important reason which leads to the litter size of Meishan pig higher than Yorkshire pig.

Key words： pig; USP18 gene; endometrium; epithelial cells; gestation; hormone

Foundation item： Jiangxi Pig Industry Technology System Construction Project（JXARS-01）; Agricultural Research Collaborative Innovation Special Funds of Jiangxi（JXXTCX2015004-001）

0 引言

【研究意義】豬附植期胚胎死亡數(shù)通常占整個妊娠期胚胎死亡總數(shù)的50%以上，且很大程度上決定了實際窩產(chǎn)仔數(shù)（Tayade et al.，2007）。梅山豬是我國優(yōu)良的地方品種，也是目前世界公認(rèn)的高產(chǎn)品種（尹洛蓉等，2011;周艷紅等，2015），在附植期間其胚胎死亡率約11%，而大白豬的胚胎死亡率高達(dá)31%（Bazer et al.，1988;Ashworth et al.，1997）。胎兒對于母體而言是半同種異基因移植物，其成功附植且不被排斥導(dǎo)致死亡與附植期子宮內(nèi)膜容受性的建立密切相關(guān)（Simón et al.，2000）。妊娠早期，子宮在雌激素和孕激素的協(xié)同調(diào)控下，通過一系列信號分子的表達(dá)變化，促使子宮內(nèi)膜形態(tài)及其功能發(fā)生改變，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜與胎兒相互作用，是胎兒成功附植的關(guān)鍵（Daikoku et al.，2011;付言峰等，2018）。因此，加強(qiáng)附植期子宮內(nèi)膜相關(guān)基因表達(dá)及調(diào)控研究，可為提高胚胎存活率和母豬窩產(chǎn)仔數(shù)提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有研究顯示，干擾素在哺乳動物的妊娠識別和維持過程中發(fā)揮著重要作用，是通過調(diào)控妊娠信號識別、子宮內(nèi)膜血管發(fā)育及免疫基因表達(dá)等方式，促使子宮內(nèi)膜形成一個可接受的植入環(huán)境（Bazer et al.，2008，2009）。泛素特異性蛋白酶18（Ubiquitin specific peptidase 18，USP18）是泛素特異性蛋白酶家族成員之一，是一種Ι型干擾素誘導(dǎo)調(diào)控因子（姚敏，2018）。USP18基因轉(zhuǎn)錄啟動子位于干擾素刺激應(yīng)答反應(yīng)元件內(nèi)，因此干擾素可強(qiáng)烈誘發(fā)機(jī)體表達(dá)USP18基因。對多種疾病和癌癥的研究發(fā)現(xiàn)，USP18通過不同信號通路反向調(diào)節(jié)Ι型干擾素在先天免疫中發(fā)揮重要作用（Kim et al.，2005;Yan et al.，2007）;尤其在癌細(xì)胞中，USP18基因下調(diào)表達(dá)可抑制體外腫瘤細(xì)胞增殖及體內(nèi)腫瘤生長，顯著降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力（Cai et al.，2017）。此外，USP18基因表達(dá)下調(diào)能抑制血管生成（Burkart et al.，2013）。胚胎附植與腫瘤發(fā)生具有極高的相似性，均是細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移及生理性侵襲的生物學(xué)過程。在敲除USP18基因的小鼠中，USP18基因缺失使得胎兒植入位點子宮內(nèi)膜的血管大量減少，胚胎發(fā)育中止，進(jìn)而導(dǎo)致胎兒死亡（Rempel et al.，2007）。在哺乳動物的正常妊娠過程中，USP18基因在妊娠早期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平明顯高于非妊娠期（Bauersachs et al.，2006;Forde et al.，2011），而在致病性腹瀉病毒感染導(dǎo)致的妊娠期胚胎死亡及子宮內(nèi)膜異位癥導(dǎo)致的繁殖障礙中，均發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜中的USP18基因表達(dá)水平顯著降低（Kiba et al.，2015;Cheng et al.，2017）。說明妊娠期間子宮內(nèi)膜中USP18基因的表達(dá)變化可能與胎兒存活密切相關(guān)?！颈狙芯壳腥朦c】目前，有關(guān)USP18基因的研究主要集中在人類、鼠和牛等物種，而針對豬的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】PCR擴(kuò)增豬USP18基因編碼區(qū)（CDS）序列，利用實時熒光定量PCR檢測USP18基因在梅山豬和大白豬不同妊娠時期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)變化，通過體外細(xì)胞試驗分析雌激素和孕激素對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中USP18基因表達(dá)的影響，并開展與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析，為揭示USP18基因在豬妊娠過程中的作用機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

選取梅山豬和大白豬初產(chǎn)母豬各6頭，配種后于妊娠15、26和50 d分別進(jìn)行屠宰。妊娠15 d母豬采用PBS沖洗子宮法確認(rèn)是否懷孕，然后隨機(jī)選取位置收集子宮內(nèi)膜組織，妊娠26和50 d母豬收集附植點子宮內(nèi)膜組織，采集的樣本經(jīng)液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存。收集廣東華農(nóng)溫氏畜牧股份有限公司水臺豬場277頭產(chǎn)6胎以上生產(chǎn)母豬的產(chǎn)活仔數(shù)（NBA）、總產(chǎn)仔數(shù)（TNB）及初生重（BW）等信息，并采集耳組織樣品，浸泡于75%乙醇中備用。用于細(xì)胞試驗的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞由計劃生育生殖生物學(xué)國家重點實驗室惠贈;RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，PCR純化試劑盒購自北京百特生物科技有限公司，內(nèi)切酶Bcc I購自MBI Fermentas公司，雌二醇和孕酮購自Sigma公司，SYBR Green Real-time PCR Master Mix試劑盒購自日本TOYOBO公司。

1. 2 組織DNA和RNA提取

采用苯酚—氯仿法提取組織DNA，以總RNA提取試劑盒（DP431）提取總RNA。提取的DNA和RNA采用Thermo Scientific公司的NanoDrop 2000核酸蛋白測定儀測定其濃度。

1. 3 基因表達(dá)檢測樣本制備

向DEPC處理無RNase污染的0.2 mL離心管中加入2.0 μg總RNA、0.4 μg Oligo（dT）引物和0.1 μg隨機(jī)引物，70 ℃溫育5 min，迅速置于冰上，然后依次加入10.0 μL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、2.5 μL 10 mmol/L dNTP Mix、1.0 μL RNase Inhibitor及1.5 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL）。樣品混勻離心后37 ℃溫育10 min，42 ℃孵育50 min，85 ℃溫育5 min。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 引物設(shè)計與合成

在GenBank中搜索豬USP18基因核苷酸序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計USP18基因檢測用引物（表1），委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1. 5 PCR擴(kuò)增、測序及生物信息學(xué)分析

PCR反應(yīng)體系25.0 ?L：cDNA模板1.0 ?L（約50 ng），上、下游引物（10 ?mol/L）各1.0 ?L，dNTPs（10 mmol/L）2.0 ?L，10×PCR Buffer 2.5 ?L，Taq DNA聚合酶（5 U/?L）0.2 ?L，滅菌水17.3 ?L。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行38個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后進(jìn)行回收測序，對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，通過NCBI網(wǎng)站的ORF Finder搜索豬USP18基因CDS序列，并進(jìn)行同源性比對分析。在NCBI網(wǎng)站中搜索人類、小鼠、大鼠、牛、狗及黑猩猩的USP18氨基酸序列，利用DNASTAR中的MegAlign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 6 實時熒光定量PCR檢測USP18基因表達(dá)情況

實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 ?L：cDNA模板0.8 ?L，SYBR Green I Mix 10.0 ?L，上、下游引物各0.4 μmol/L，以無核酸水補(bǔ)足至20.0 ?L。混勻離心后使用ABI 7300實時定量PCR儀同時擴(kuò)增USP18基因和TBP1基因（內(nèi)參），擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 s;95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行40個循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。使用USP18基因與TBP1基因的平均Ct差值ΔCt計算USP18基因的相對表達(dá)量，再以ΔCt減去ΔCt最大值得到ΔΔCt，通過2-ΔΔCt法分析USP18基因的差異表達(dá)情況。

1. 7 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞至良好狀態(tài)，用含Hyclone胎牛血清（去激素血清）的無酚紅培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，傳代至6孔板。分別設(shè)試驗組和對照組，每組設(shè)3個重復(fù)，其中，對照組添加0.03%乙醇，試驗組添加10-10 mol/L雌二醇和10-8 mol/L孕酮。培養(yǎng)12、24和48 h后，收集細(xì)胞并提取RNA，采用實時熒光定量PCR檢測USP18基因的表達(dá)量。

1. 8 PCR-RFLP基因分型及產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析

擴(kuò)增產(chǎn)物檢測合格后，65 ℃下酶切消化過夜。酶切體系10.0 ?L：擴(kuò)增模板3.0 ?L，內(nèi)切酶（10 U/?L）1.5 ?L，滅菌水5.5 ?L。酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測分型后，統(tǒng)計基因型數(shù)據(jù)，使用SPSS 19.0中的一般線性模型（GLM）對母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀與SNP位點分型結(jié)果進(jìn)行最小二乘法分析。一般線性模型為：yi=μ+αi+pk+ei，式中，yi為性狀值，μ為總體平均數(shù)，αi為基因型效應(yīng)值（i=GG，TG，TT），pk為胎次效應(yīng)（按初產(chǎn)和經(jīng)產(chǎn)劃分），ei為隨機(jī)誤差。

2 結(jié)果與分析

2. 1 豬USP18基因序列分離及氨基酸同源性分析結(jié)果

利用引物U-CDS1和U-CDS2分別擴(kuò)增豬USP18基因cDNA序列，克隆測序后拼接得到完整的CDS序列（966 bp），編碼322個氨基酸殘基，編碼蛋白分子量為37 kD，理論等電點（pI）為6.74。與人類及鼠、牛等其他哺乳動物進(jìn)行USP18氨基酸同源性比對分析，結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)豬USP18氨基酸序列與牛和狗的USP18氨基酸序列同源性最高，均為82%;與人類和猩猩的USP18氨基酸序列同源性分別為76%和75%;與小鼠和大鼠的USP18氨基酸序列同源性均為68%。利用MegAlign進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果（圖1）也顯示豬與牛的遺傳距離最近。

2. 2 豬妊娠期子宮內(nèi)膜組織中USP18基因表達(dá)水平檢測結(jié)果

利用實時熒光定量PCR檢測妊娠15、26和50 d梅山豬和大白豬子宮內(nèi)膜組織中USP18基因的表達(dá)水平，結(jié)果（圖2）顯示，USP18基因在妊娠15和26 d梅山豬和大白豬子宮內(nèi)膜中的相對表達(dá)量均明顯高于妊娠50 d，且在妊娠26和50 d，USP18基因在梅山豬子宮內(nèi)膜組織中的相對表達(dá)量顯著高于在大白豬子宮內(nèi)膜組織中的相對表達(dá)量（P<0.05，下同）。

2. 3 激素處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞后USP18基因的表達(dá)變化情況

以10-10 mol/L雌二醇和10-8 mol/L孕酮聯(lián)合處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，在處理0、12、24和48 h后分別收集上皮細(xì)胞，提取其RNA，再利用實時熒光定量PCR檢測USP18基因的表達(dá)水平。結(jié)果（圖3）顯示，激素處理12、24和48 h后USP18基因在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的相對表達(dá)量呈上調(diào)趨勢，且顯著高于激素處理前的相對表達(dá)量。

2. 4 豬USP18基因SNP位點驗證及其與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

對豬USP18基因測序結(jié)果進(jìn)行比對分析，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)在豬USP18基因CDS序列953 bp處存在1個SNP位點（T/G錯義突變），導(dǎo)致氨基酸序列第318位由甲硫氨酸（Met）突變?yōu)榫彼幔ˋrg），且被內(nèi)切酶Bcc I所識別。利用引物U-Bcc I擴(kuò)增包含SNP位點的基因序列并進(jìn)行酶切，GG基因型的酶切產(chǎn)物大小為150 bp，TT基因型的酶切產(chǎn)物大小為127 bp（圖5）。進(jìn)一步利用PCR-RFLP檢測USP18基因T953G位點在277頭長白母豬中的基因型，并以SPSS 19.0分析不同基因型與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明，在初產(chǎn)母豬中，USP18基因T953G位點不同基因型母豬在總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)和初生重性狀中不存在顯著差異（P>0.05）;而在經(jīng)產(chǎn)母豬中，TG基因型母豬產(chǎn)活仔數(shù)最多，GG基因型母豬產(chǎn)活仔數(shù)最少，且差異顯著（表3）。

3 討論

胎兒在附植過程中會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜產(chǎn)生免疫反應(yīng)。正常妊娠狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜中的淋巴細(xì)胞由Th1型向Th2型轉(zhuǎn)換，對胎兒存活并成功附植極其關(guān)鍵（Raghupathy et al.，2000）。Th1細(xì)胞誘導(dǎo)超敏反應(yīng)，抑制胚胎在子宮內(nèi)附植;而Th2細(xì)胞促進(jìn)抗體形成，抑制免疫炎癥，有利于胚胎著床和發(fā)育（Aluvihare et al.，2004）。USP18基因是動物體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的重要功能基因。在乳腺上皮細(xì)胞中，USP18基因缺失會導(dǎo)致Th1細(xì)胞趨化因子基因Cxcl10表達(dá)增加，從而募集Th1型T淋巴細(xì)胞（Burkart et al.，2013）。Tnf-α是Th1型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子之一，其過量表達(dá)會抑制胚胎著床，導(dǎo)致妊娠終止（Li et al.，2017）。USP18基因表達(dá)水平上升，可有效抑制Tnf-α表達(dá)（MacParland et al.，2016;Shaabani et al.，2018）。說明附植期間USP18基因在子宮內(nèi)膜中的高水平表達(dá)可能有利于胚胎附植。在牛的相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)，USP18基因在附植期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平明顯高于非妊娠時期（Bauersachs et al.，2006;Forde et al.，2011）。本研究利用實時熒光定量PCR檢測分析USP18基因在母豬妊娠15、26和50 d子宮內(nèi)膜中的表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP18基因在妊娠15和26 d梅山豬和大白豬子宮內(nèi)膜中的相對表達(dá)量均明顯高于妊娠50 d。在妊娠過程中，USP18基因在附植時期子宮內(nèi)膜中的高水平表達(dá)是胎兒附植和妊娠建立的關(guān)鍵。

豐富的血管有助于子宮內(nèi)膜對胎兒胎盤的營養(yǎng)供給，從而提高胚胎存活率（Argente et al.，2006）。相對于大白豬等外來品種，梅山豬在妊娠26和50 d的胚胎正常附植點血管豐度明顯更高，可能是導(dǎo)致梅山豬產(chǎn)仔數(shù)高于大白豬的一個重要因素（張高英，2009）。已有研究表明，USP18基因可通過抑制Ι型干擾素信號通路而促進(jìn)血管生成（Hsu et al.，2017）。本研究結(jié)果也表明，USP18基因在梅山豬和大白豬附植期子宮內(nèi)膜中的相對表達(dá)量均高于附植完成期，且在妊娠26和50 d梅山豬子宮內(nèi)膜組織中的相對表達(dá)量顯著高于在大白豬子宮內(nèi)膜組織中的相對表達(dá)量。由此推測，USP18基因通過參與妊娠早中期子宮內(nèi)膜血管發(fā)育從而影響胎兒存活。

雌激素和孕激素在妊娠建立過程中發(fā)揮著重要作用。在母豬妊娠早期，雌激素和孕激素分泌階段性增加，且梅山豬附植期高胚胎存活率與雌激素和孕激素的高分泌水平密切相關(guān)（Hunter et al.，1996）。已有研究顯示，雌激素和孕激素通過協(xié)同作用，可有效誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜中Th1型細(xì)胞向Th2型細(xì)胞轉(zhuǎn)化，且在妊娠期間雌激素和孕激素水平的增加與血管形成密切相關(guān)（Liu et al.，2002;Salem，2004）。Satterfield等（2009）通過體外注射孕酮，發(fā)現(xiàn)在羊妊娠12 d的子宮內(nèi)膜組織中USP18基因表達(dá)水平顯著增加。本研究通過體外細(xì)胞試驗檢測雌二醇和孕酮聯(lián)合處理對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞USP18基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，雌二醇和孕酮聯(lián)合作用可有效誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中USP18基因的表達(dá)?？梢?，在妊娠早期，雌激素和孕激素的高分泌水平有助于提高子宮內(nèi)膜中USP18基因的表達(dá)，但是否存在劑量依賴性還有待進(jìn)一步探究。

Bauersachs等（2006）、Forde等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，牛USP18基因在附植期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平明顯高于非妊娠時期，故推測USP18基因在牛子宮內(nèi)膜中可作為檢測子宮內(nèi)膜容受性的分子標(biāo)記。Shen等（2014）同樣發(fā)現(xiàn)在豬妊娠14 d外周血中USP18基因的表達(dá)量顯著高于非妊娠狀態(tài)，說明其與早期妊娠密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)USP18基因在豬附植期子宮內(nèi)膜中呈高水平表達(dá)，且在梅山豬中的表達(dá)水平高于大白豬，表明USP18基因在豬妊娠早期發(fā)揮著重要作用?；诖?，本研究進(jìn)一步對測序篩選獲得的USP18基因T953G位點進(jìn)行產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在經(jīng)產(chǎn)母豬中USP18基因T953G位點TG基因型母豬的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)均最多，且在產(chǎn)活仔數(shù)性狀方面存在顯著差異。但本研究的豬個體數(shù)量較少，因此還需加大樣本數(shù)量進(jìn)一步驗證結(jié)果的可靠性。

4 結(jié)論

豬USP18基因在附植期子宮內(nèi)膜中高水平表達(dá)，且在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)受雌激素和孕激素誘導(dǎo)，表明USP18基因在妊娠早期建立過程中發(fā)揮著重要作用。USP18基因在梅山豬和大白豬間的差異表達(dá)可能是導(dǎo)致梅山豬產(chǎn)仔數(shù)高于大白豬的一個重要因素。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）