湖北和廣西辣椒脈斑駁病毒的檢測及遺傳多樣性分析

李桑桑 胡榮 羅香文 李詩君 卜珊 張宇 劉勇 張松柏

摘要：【目的】研究辣椒脈斑駁病毒（Pepper veinal mottle virus，PVMV）的分布及遺傳變異，為明確該病毒在我國的流行擴散分子機制提供理論依據。【方法】利用特異性引物反轉錄PCR（RT-PCR）檢測從湖北宜昌及廣西南寧和百色采集的48份疑似感染PVMV的辣椒樣本;采用常規(guī)Sanger測序測定PCR產物序列，序列采用MEGA 5.0構建系統發(fā)育進化樹，采用RDP等算法分析其可能的重組事件;采用DnaSP v5分析病毒株系不同群體之間的基因流及基因差異。【結果】從48份辣椒樣本中檢測到5份樣本被PVMV侵染，檢出率10.42%。基因同源性比對分析結果表明，測定的PVMV湖北和廣西分離物CP基因序列同源性在97.00%以上，與其他地區(qū)分離物的同源性為91.73%～98.78%。系統發(fā)育分析表明，湖北（YC）和廣西（NN）PVMV分離物與我國臺灣PVMV分離物的親緣關系最近。重組分析表明，PVMV廣西分離物NN10有2個重組事件?！窘Y論】湖北和廣西辣椒的PVMV檢測結果表明，該病毒已擴散至湖北和廣西;基因突變可能是PVMV湖北分離物遺傳變異的主要方式之一;而基因重組和基因突變可能是PVMV廣西分離物遺傳變異的重要因子。

關鍵詞： 辣椒脈斑駁病毒;RT-PCR;系統發(fā)育分析;重組;湖北;廣西

中圖分類號： S436.418.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）07-1693-06

Abstract：【Objective】This study aimed to define the distribution and genetic variation of Pepper veinal mottle virus（PVMV）， the results would be contributed to understanding the dispersing molecular mechanism of PVMV in China. 【Method】PVMV was identified by specific primer reverse transcription PCR（RT-PCR） from 48 suspected pepper samples， which collected from Yichang in Hubei， and Nanning and Baise in Guangxi， and amplified products by PCR were sequenced by Sanger sequencing. The phylogenetic tree was constructed by MEGA 5.0. The recombinant events were analyzed by RDP algorithm. The gene flow and gene differentiation of different populations of PVMV isolates was analyzed by DnaSP v5. 【Result】There werefive PVMV positive pepper samples confirmed by RT-PCR among the 48 samples， and the incidence of PVMV in Hubei and Guangxi was 10.42%. According to gene homology detection， the sequences of CP genes of Hubei and Guangxi isolates shared over 97.00% identity with each other， and shared 91.72%-98.78% with isolates from others areas. Phylogenetic analysis showed the relationship of Hubei（YC） and Guangxi（NN） isolates had the closest relation isolates of Taiwan of China. There were two recombinant events detected in PVMV Guangxi isolate NN10. 【Conclusion】The survey and detection of PVMV shows that PVMV has infected pepper plants in Hubei and Guangxi.Gene mutation may be one of key patterns for evolution of PVMV Hubei isolates， and gene mutation and recombinant are probably key factors for PVMV guangxi isolates evolution.

Key words： Pepper veinal mottle virus; RT-PCR; phylogenetic analysis; recombination; Hubei; Guangxi

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（317017765）

0 引言

【研究意義】辣椒脈斑駁病毒（Pepper veinal mottle virus，PVMV）是近年來我國辣椒上的一種新發(fā)病毒（Cheng et al.，2011; Zhang et al.，2016）。該病毒侵染辣椒，能導致辣椒整株矮縮、葉片畸形、葉脈暗綠，葉片、花易掉落，果實畸形或著色不均勻，嚴重影響辣椒的產品和品質（Tsai et al.，2010）。PVMV屬馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）馬鈴薯病毒科（Potyviridae）成員，該屬植物病毒寄主范圍廣，既能通過傳毒介體蚜蟲傳播，也可通過病株汁液或機械接觸方式傳播，且傳播速度快，危害嚴重（Rajam?ki et al.，2004）。因此，明確PVMV在我國辣椒主產區(qū)的發(fā)生情況及不同地區(qū)分離物的遺傳變異，對于明確該病毒對我國辣椒的潛在威脅具有非常重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】PVMV于1971年在加納北部的辣椒和矮牽牛上首次被發(fā)現（Brunt et al.，1978），隨后非洲南部多國報道PVMV侵染多種茄科重要作物，如番茄、辣椒、茄子和煙草等（Atiri，1986;Alegbejo，1999）;此外，該病毒已蔓延到非洲西北部多國，嚴重影響辣椒和番茄的生產（Moury et al.，2005;Tsai et al.，2010;Arogundade et al.，2012）。在亞洲地區(qū)，我國臺灣省首先報道該病毒危害辣椒和番茄（Cheng et al.，2009，2011），隨后在我國其他地區(qū)也發(fā)現該病毒為害（Zhang et al.，2016;劉健等，2016;王莉爽等，2017）。目前，有關PVMV的研究主要集中在基因組序列測定與分析、病毒與寄主互作分子機制等方面。Zhang等（2015）研究表明，PVMV分離物存在明顯的區(qū)域分化，侵染我國湖南省辣椒的PVMV分離物與我國臺灣分離物的親緣關系最近，湖南分離物可能是一個新穎的重組子。Akinyemi等（2016）采用高通量測序技術研究發(fā)現，PVMV與其他植物病毒共同侵染煙草，并組裝了PVMV的全基因組序列。王莉爽等（2017）研究表明，貴州辣椒PVMV分離物與四川和云南分離物的親緣關系最近，且存在明顯的遺傳變異。Bolou Bi等（2018）發(fā)現侵染辣椒的PVMV不同分離物存在明顯的遺傳分化。Laina等（2019）研究發(fā)現日本PVMV分離物與非洲分離物的親緣關系最近。Moury等（2020）研究表明，寄主基因eIF4E2是PVMV復制所必須的寄主因子。以上研究表明，PVMV呈現快速擴展態(tài)勢，且不同地區(qū)存在明顯的遺傳變異?！颈狙芯壳腥朦c】雖然PVMV在我國多個省份發(fā)生為害，但在我國的具體分布及其分離物的遺傳變異均需進一步研究?！緮M解決的關鍵問題】湖南省植物保護研究所已報道PVMV湖南分離物全基因組序列（Zhang et al.，2015），以該基因組序列和GenBank中公布的其他PVMV全基因組序列為模板，設計特異性反轉錄PCR（RT-PCR）引物擴增PVMV CP基因，檢測從湖北和廣西采集的疑似感染PVMV的辣椒樣本，明確PVMV的分布;采用常規(guī)Sanger測序測定PCR產物序列，分析序列的遺傳變異，為揭示該病毒的流行擴散分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試辣椒樣本于2017年7月和2019年8月分別采集自湖北宜昌及廣西南寧和百色。采集的辣椒樣本有明顯的病毒侵染癥狀，包括植株略矮化，葉片畸形、斑駁等。辣椒樣本共計48份，相關信息見表1。

TRIzol試劑、一步法RT-PCR試劑盒和凝膠DNA回收試劑盒等均購自北京全式金生物技術有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 總RNA抽提 辣椒葉片總RNA抽提采用TRIzol試劑，具體步驟參照說明書。

1. 2. 2 RT-PCR檢測 采用Primer 5.0設計PVMV特異性PCR檢測引物，以PVMV湖南分離物全基因組（GenBank登錄號KR002568）為模板，設計擴增PVMV CP基因的特異性引物（CP-F：5'-AATTAAG CCATTGATTGACCA-3'，CP-R：5'-AGCGCCAATTA TGAAACCGC-3'）。PVMV特異性RT-PCR，采用一步法RT-PCR試劑盒，RT-PCR體系20.0 ?L：RNA模板1.0 ?L，dNTPs（10 mmol/L）1.0 ?L，隨機六聚體引物（50 ?mol/L）1.0 ?L，PrimeScript II PCR Buffer 4.0 ?L，上、下游引物各0.5 ?L，反轉錄/聚合酶混合物0.5 ?L，RNase inhibitor（40 U/?L） 0.5 ?L，加RNase-free ddH2O至20.0 ?L。RT-PCR擴增程序：65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán);72 ℃10 min，4 ℃保存。PCR產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 2. 3 序列測定 采用凝膠DNA回收試劑盒回收PCR特異性條帶，具體步驟參照說明書。回收純化的PCR產物由生工生物工程（上海）股份有限公司采用常規(guī)Sanger測序技術測序。

1. 3 核苷酸序列分析

采用CLUSTAL W對PVMV不同分離物的CP基因序列進行多序列聯配，采用MEGA 5.0構建最大似然法（Maximum-likelihood）系統發(fā)育進化樹（Tamura et al.，2011）。利用MaxChi（Smith，1992）、GENECONV（Padidam et al.，1999）、SISCAN（Gibbs et al.，2000）、CHIMAERA（Posada and Crandall，2001）、RDP4軟件的BOOTSCAN（Martin et al.，2015）和Recombination Detection Program（RDP）（Martin et al.，2015）進行PVMV不同分離物間的序列重組分析。PVMV不同分離物之間的序列突變采用MEGA 5.0分析最大可能性堿基替換（Tamura et al.，2011）。采用DnaSP v5分析PVMV不同群體之間的基因流及基因差異（Librado and Rozas，2009）。

2 結果與分析

2. 1 PVMV檢出率

對湖北和廣西的48份辣椒樣本進行RT-PCR檢測，得到大小為761 bp的特異性條帶，與預期結果一致（圖1）。共有5份PVMV陽性樣本被檢出，其中宜昌遠安縣2份，其他3個地區(qū)各1份。湖北和廣西辣椒的PVMV檢出率為10.42%。

2. 2 PVMV序列系統發(fā)育分析結果

將測定的PVMV湖北和廣西分離物的CP基因序列片段在GenBank中進行核苷酸序列BLAST比對，結果表明，PVMV湖北和廣西分離物的CP基因序列之間的同源性在97.00%以上，與其他地區(qū)分離物的同源性為91.73%～98.78%。

序列系統發(fā)育分析結果（圖2）表明，湖北分離物（YC）與廣西分離物（NN）親緣關系最近，聚為一個亞簇;兩個省份的PVMV分離物與我國臺灣PVMV分離物ns1（FJ617225）的親緣關系最近。

2. 3 PVMV序列重組分析結果

PVMV序列重組分析結果（表2）顯示，分別有3種算法得到廣西PVMV分離物NN10的CP基因序列有2個重組事件：重組事件1（算法RDP、Geneconv和SiScan）的主要序列來源和次要序列來源分別是非洲尼日利亞（Nigeria）分離物NG_12P_Ow1和一個未知分離物;重組事件2（算法Geneconv、MaxChi和SiScan）的主要序列來源和次要序列來源分別是非洲尼日利亞（Nigeria）分離物NG_12P_Ow1和湖北的分離物YC1。

2. 4 PVMV序列突變分析結果

PVMV CP基因的突變分析結果表明，PVMV分離物CP基因的堿基頻率分別為：A（0.319）、T（0.249）、C（0.203）和G（0.229）;嘌呤（A/G）的替換/轉換率（k1）為3.390，嘧啶（C/T）的替換/轉換率（k2）為7.896。PVMV CP基因總體的堿基替換/轉換率（R）為2.226，以嘧啶（C/T）的替換/轉換（26.44）為主（表3）。

2. 5 PVMV序列基因流及基因變異分析結果

將PVMV分離物CP基因序列分為我國分離物群（I亞群）和國外分離物群（II亞群）兩個群體，采用DnaSP v5分析兩個群體間CP基因的變異及基因流。兩個群體CP基因的基因變異分析結果（表4）表明，我國PVMV分離物群體CP基因的分離位點數量（Ss）、平均差異位點數（k）和核苷酸多態(tài)性（Pi）分別為13、5.36和0.014;而國外PVMV分離物群體的CP基因的Ss、k和Pi分別為39、17.53和0.047;兩個群體CP基因的基因流分析結果表明，群體間的遺傳變異（Fst）為0.24，兩個群體間的基因交換頻率（Nm）低（0.78）。

3 討論

PVMV屬馬鈴薯Y病毒屬馬鈴薯病毒科成員，能通過多種方式傳播，目前在我國呈快速擴展的趨勢（燕照玲等，2017）。本研究結果表明PVMV已擴散至華中地區(qū)的湖北和西南地區(qū)的廣西，進一步證實該病毒在我國快速擴散，結合其他地區(qū)的報道（Cheng et al.，2011;Zhang et al.，2016;劉健等，2016;王莉爽等，2017），表明該病毒可能在我國絕大多數辣椒主產區(qū)發(fā)生危害。由于該病毒侵染辣椒，會導致辣椒嚴重減產，因此，急需加強抗性育種以及應急防控技術措施等方面的研究與應用。

PVMV序列系統發(fā)育分析結果表明，湖北和廣西PVMV分離物與我國臺灣分離物的親緣關系最近，該結果與Zhang等（2015）的研究結果存在一定差異，Zhang等（2015）研究發(fā)現PVMV湖南分離物與我國臺灣和非洲加納分離物親緣關系最近。而最新研究表明，PVMV日本分離物與東南亞分離物的親緣關系最近，與非洲分離物的親緣關系較遠（Laina et al.，2019）。根據上述研究結果，可推測不同地區(qū)的PVMV分離物可能存在不同的選擇壓力，因此，其基因組可能通過不同方式進行適應性進化。

研究表明，植物病毒序列重組和突變等遺傳變異是植物病毒適應性進化最重要的兩種方式;正鏈RNA植物病毒通過基因重組和（或）突變，可促進基因組序列的變異，從而改變病毒群體，以適應寄主品種或環(huán)境等的選擇壓力（Bentley and Evans，2018）。對貴州PVMV分離物的研究表明，貴州分離物存在明顯的株系分化，但是未深入分析其分化的分子機理（王莉爽等，2017）。湖南PVMV分離物全基因組分析表明，PVMV湖南分離物是一個新穎的重組子，表明重組可能在PVMV遺傳進化中發(fā)揮重要作用（Zhang et al.，2015）。本研究分析推測，廣西南寧PVMV分離物與非洲尼日利亞分離物和我國湖北分離物存在重組，因此，廣西南寧的PVMV分離物可能與湖南分離物相似，通過重組的方式改變其基因，從而適應性進化。

然而，PVMV湖北分離物的CP基因序列沒有重組事件，可能通過其他方式進行適應性進化。研究表明，在寄主與病原物的互作中，寄主與病原物存在共同進化的現象（Samantha et al.，2004）;而在寄主—病原物共同進化過程中，基因突變（Yin et al.，2013）和基因轉移（Wei et al.，2009）是植物病原物遺傳變異的重要方式。對病毒及寄主（宿主）的研究表明，基因的水平轉移在細菌及病毒致病性、寄主和環(huán)境的適應性中發(fā)揮重要作用（Dr?ge et al.，1999;Bahl et al.，2009）。本研究結果表明，PVMV湖北和廣西分離物的CP基因存在明顯的核苷酸堿基替換/轉換率（R=2.226），以嘧啶（C/T）的替換/轉換為主，由此推測PVMV湖北和廣西分離物的基因突變可能也是該病毒遺傳變異的主要方式。PVMV湖北和廣西分離物CP基因序列的基因流分析表明，國外PVMV群體的多態(tài)性明顯高于我國PVMV分離物群體;而且國外PVMV分離物群體與我國PVMV分離物群體間CP基因的遺傳變異（Fst）為0.24，兩個群體間的基因交換頻率（Nm）低（0.78）。有研究表明，地區(qū)隔離是影響病毒分離物之間基因交流的重要因素（Lam et al.，2012），由此推測，我國PVMV群體與國外群體可能由于地域隔離，導致相互之間的基因交換頻率低，表明基因轉移不是我國PVMV分離物遺傳變異的主要因素。

為明確PVMV在我國辣椒等茄科主要經濟作物主產區(qū)的快速擴散分子機制，急需測定更多地區(qū)PVMV分離物的序列，分析其遺傳變異的方式，研究結果可為揭示該病毒的快速擴散提供科學依據，也為抗性育種等研究提供理論參考。

4 結論

湖北和廣西辣椒的PVMV檢測結果表明，該病毒已擴散至湖北和廣西;基因突變可能是PVMV湖北分離物遺傳變異的主要方式之一;而基因重組和基因突變可能是PVMV廣西分離物遺傳變異的重要因子。

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（責任編輯 麻小燕）