應(yīng)用IlluminaMiSeq高通量測(cè)序技術(shù)分析堇葉碎米薺根際土壤微生物多樣性

陳菲菲 叢欣 向極釬

摘要：以生長(zhǎng)野生堇葉碎米薺（Cardamine violifolia O. E Schulz）的3個(gè)地區(qū)（湖北省恩施市雙河鎮(zhèn)、湖北省宜昌市五峰縣、湖南省常德市石門縣）的9個(gè)根際土壤樣品為材料，應(yīng)用 Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)分析其微生物群落的多樣性。結(jié)果顯示，來自恩施市雙河鎮(zhèn)土樣S1與來自宜昌市五峰縣土樣S2微生物類群的一致性最高，差異較小，S1與來自常德市石門縣土樣S3、S2與S3土樣微生物類群一致性較低。多樣性指數(shù)和稀釋性曲線分析得出，在9個(gè)土壤樣品中，來自恩施市雙河鎮(zhèn)土樣的S1.2號(hào)Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最小;來自常德市石門縣土樣的S3.2號(hào)Shannon指數(shù)最小，Simpson指數(shù)最大，說明恩施市雙河鎮(zhèn)土樣的群落多樣性最高，常德市石門縣土樣的群落多樣性最低。3個(gè)地區(qū)土樣中占優(yōu)勢(shì)的菌門均為變形菌門（Proteobacteria）;共有的菌門有泉古菌門（Crenarchaeota）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、衣原體門（Chlamydiae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、OD1、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門、疣微菌門（Verrucomicrobia）和WS3。

關(guān)鍵詞：堇葉碎米薺（Cardamine violifolia O. E Schulz）;Illumina MiSeq 高通量測(cè)序;根際土壤;微生物多樣性

中圖分類號(hào)：Q948.15;Q938 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）17-0058-05

Abstract： Taking nine soil samples growing Cardamine violifolia O. E Schulz from three area （Shuanghe town， Enshi city; Wufeng county， Yichang city， Hubei province and Shimen county， Changde city， Hunan province） as materials， the microbial community structure and diversity were analyzed by using Illumina MiSeq high-throughput sequencing system. The results showed that the microbial community composition of S1 soil sample form Shuanghe and S2 soil sample from Wufeng were similar， but the composition were quite different between S1 soil sample and S3 soil sample from Shimen， and were different between S2 and S3 soil sample. The diversity index and rarefaction curves analysis showed that in nine soil samples， the highest microbial diversity was No. S1.2 soil sample from Shuanghe and the lowest microbial diversity was No. S3.2 soil sample from Shimen. It indicated that the community diversity of Shuanghe soil sample was the highest and that of Shimen soil sample was the lowest. Proteobacteria was the dominant population in three area soil. The same phyla of the three area were Crenarchaeota， Acidobacteria， Actinobacteria， Bacteroidetes， Chlamydiae， Chloroflexi， Firmicutes， Gemmatimonadetes， Nitrospirae， OD1， Planctomycetes， Proteobacteria， Verrucomicrobia and WS3.

Key words： Cardamine violifolia O. E Schulz; Illumina MiSeq high-throughput sequencing; rizosphere soil; microbial diversity

植物根際微生物是一個(gè)特殊的微生態(tài)環(huán)境，聚居著各種微生物，有細(xì)菌、真菌、放線菌、病毒等。這些微生物在根上的生長(zhǎng)、分布和繁殖受植物根系生長(zhǎng)發(fā)育的影響，表現(xiàn)出明顯的根際效應(yīng)，對(duì)根系吸收和轉(zhuǎn)化土壤中的微量元素有重要作用[1]。1997年，Azaizeh等[2]首先發(fā)現(xiàn)了植物與其根際微生物之間的相互作用。他們利用人造濕地清除索爾頓湖中高含量的硒，在此過程中發(fā)現(xiàn)根際微生物參與亞硒酸鹽的還原與揮發(fā)，且硒清除效率比空白對(duì)照組高3～5倍。之后，該研究組對(duì)根際微生物進(jìn)行了針對(duì)性試驗(yàn)，通過抑制或不抑制蘆葦和兔腳草的根際微生物參與這兩種植物對(duì)土壤中硒與汞的吸收，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有根際微生物參與的試驗(yàn)組對(duì)硒和汞的積累水平有顯著提高[3]。此后，根際微生物在植物對(duì)微量元素的積累中的作用在更多的植物中被發(fā)現(xiàn)，包括小麥、蘿卜、豆科植物、生菜等[4-7]。

近年來，高通量測(cè)序技術(shù)越來越多地被使用在對(duì)植物土壤微生物多樣性的研究上，是目前應(yīng)用最普遍的新一代測(cè)序技術(shù)。其優(yōu)勢(shì)是能夠從樣本中提取總DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并測(cè)序[7]，以此來估計(jì)樣本中微生物群落的物種組成，能更清晰地展示出其多樣性和復(fù)雜性[8-10]。2012年，Yousuf等[11]利用高通量測(cè)序手段對(duì)印度沿海鹽堿地微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)樣地中微生物群落組成存在顯著差異;2013年，趙婉雨等[12]研究了柴達(dá)木盆地達(dá)布遜鹽湖微生物多樣性，利用高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌豐度和多樣性高于古菌，且放線菌門占了53%;2015年，王淑玉等[13]對(duì)不同質(zhì)地土壤煙株根際微生物菌群變化做了分析，發(fā)現(xiàn)根際微生物的結(jié)構(gòu)與發(fā)病率有相關(guān)性;2016年，李新等[14]對(duì)內(nèi)蒙古自治區(qū)河套灌區(qū)3類不同鹽堿程度的土壤微生物群落多樣性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)變形菌門的微生物是這種土壤的優(yōu)勢(shì)菌群;2017年，牛世全等[15]研究了河西走廊地區(qū)鹽堿土壤微生物群落多樣性，發(fā)現(xiàn)次生鹽堿土壤中微生物類群多樣性最豐富。之后，關(guān)于不同土壤不同環(huán)境下植物的根際微生物的研究越來越多，包括葡萄、牡丹、太子參、苧麻、獼猴桃、草莓等[16-22]。

本研究以生長(zhǎng)野生堇葉碎米薺（Cardamine violifolia O. E Schulz）的3個(gè)地區(qū)（湖北省恩施市雙河鎮(zhèn)、湖北省宜昌市五峰縣、湖南省常德市石門縣）的9個(gè)根際土壤樣品為材料，分析了該野生堇葉碎米薺根際微生物群落的多樣性，以期為堇葉碎米薺根際耐硒菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域

在3處自然生長(zhǎng)堇葉碎米薺的地點(diǎn)進(jìn)行采樣，即湖北省恩施市新塘鄉(xiāng)雙河鎮(zhèn)魚塘壩村、湖北省宜昌市五峰縣采花鄉(xiāng)栗子坪村以及湖南省常德市石門縣壺瓶山鎮(zhèn)三河村，采樣點(diǎn)基本信息詳見表1。

1.2 樣品采集

將所有接觸樣品的采樣物品均做高壓滅菌處理，帶去采樣地點(diǎn)，采用五點(diǎn)取樣法采集土樣，在每個(gè)地點(diǎn)采集3～5株生長(zhǎng)良好的堇葉碎米薺的根際土壤，即將堇葉碎米薺連根拔起后，抖掉表面的浮土，取0～20 cm的土壤樣品保存于滅菌的密封袋中，每個(gè)樣品收集根際土壤50～100 g，置于冰袋中冷藏迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，土樣在-80 ℃下保存，用于土壤微生物種群結(jié)構(gòu)多樣性分析。

1.3 儀器與設(shè)備

MO BIO Power Soil? DNA Isolation Kit土壤DNA提取試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒，美國(guó)MO BIO有限公司;核酸蛋白濃度測(cè)定儀Nanodrop One，賽默飛世爾科技公司;凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂公司;電泳儀，北京六一儀器廠;H-1650R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司;721分光光度計(jì)、K9840自動(dòng)凱氏定氮儀，上海儀電分析儀器有限公司;WFX-210 原子吸收分光光度計(jì)，北京瑞利公司。

1.4 方法

1.4.1 土壤總DNA的提取及16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增 采用MO BIO Power Soil? DNA Isolation Kit對(duì)樣品進(jìn)行基因組DNA提取，并用Nanodrop One測(cè)定基因組DNA濃度。

調(diào)節(jié)樣本DNA濃度至合適范圍之后，采用引物 515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTT-3′）擴(kuò)增土壤微生物16S rRNA 基因V4-V5區(qū)。50 μL PCR反應(yīng)體系：2×Premix Taq 25.0 μL，模板（20 ng/μL）3.0 μL，引物F（20 ng/μL）1.0 μL，引物R（20 ng/μL）1.0 μL，滅菌超純水20.0 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min;4 ℃保持。每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，并將同一樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合。擴(kuò)增后的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V、30 min）。檢測(cè)PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度和濃度。

1.4.2 Pooling及切膠純化 利用Gene tools analysis software（Version 4.03.05.0，Syn Gene）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行濃度對(duì)比后，按照等質(zhì)量原則計(jì)算各樣品所需體積，將各PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合。使用EZNA Gel Extraction Kit（Omega，USA）凝膠回收試劑盒回收PCR混合產(chǎn)物，TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。

1.4.3 測(cè)序及分析 經(jīng)處理后的樣品送至武漢中圣泰克生物科技有限公司，利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本DNA提取結(jié)果

采用試劑盒提取樣本DNA后，用Nanodrop One測(cè)定基因組DNA濃度，各樣品濃度及質(zhì)量均能達(dá)到A類，即DNA濃度≥20 ng/μL、1.7≤A260 nm/A280 nm≤2.0、A260 nm/A230 nm≥1.0、體積≥15 μL，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析結(jié)果

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行圖像識(shí)別（Base calling），獲取測(cè)定序列及質(zhì)量值，對(duì)各樣本數(shù)據(jù)量及測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)低質(zhì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，去除嵌合體、singleton OTU（只有1條代表序列的OTU）、污染OTU（葉綠體、線粒體以及不能注釋到界級(jí)別的OTU）及接頭序列，優(yōu)化后數(shù)據(jù)量及質(zhì)量統(tǒng)計(jì)見表2，得到有效Tags序列數(shù)。從表2可以看出，9個(gè)樣本的最終有效Tags總共有 ?124 798 bp序列被測(cè)出，每個(gè)樣本平均13 866 bp。

2.3 OTU聚類分析

如圖1所示，其中S1組共得到2 378個(gè)OTU，S2組共得到2 316個(gè)OTU，S3組共得到2 214 個(gè)OTU。分別將這3組樣品進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，S1與S2共有的OTU為1 332個(gè)，S1與S3共有的OTU為1 169個(gè)，S2與S3共有的OTU為1 115個(gè)。S1中特有的OTU為814個(gè)，S2中特有的OTU為806個(gè)，S3中特有的OTU為867個(gè)。這3組的OTU數(shù)一共為4 229個(gè)，其中包含共同的OTU數(shù)有937個(gè)。

不同類型的土壤中所含OTU數(shù)S1>S2>S3，說明了恩施市雙河鎮(zhèn)土樣的微生物類群最豐富，常德市石門縣土樣的微生物類群最少。來自恩施市雙河鎮(zhèn)的S1土樣與來自宜昌市五峰縣的S2土樣微生物類群的一致性最高，差異較小，S1與來自常德市石門縣的 S3土樣、S2與S3土樣微生物類群一致性較低。圖1表明這3種土壤類型有部分一致的微生物類群，且從整體來看差異不明顯。

2.4 16S rRNA 基因序列測(cè)序深度分析

從圖2可以看出，9個(gè)樣品的稀釋曲線均基本上趨于平緩，說明測(cè)序趨于飽和，取樣基本合理，能夠比較真實(shí)地反映出這9個(gè)土壤樣品中的微生物群落，結(jié)合各樣品覆蓋率，說明測(cè)序結(jié)果中包含了大多數(shù)微生物類群，基本可以反映該區(qū)域土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)組成，但可能仍有少量微生物種類未被發(fā)現(xiàn)。

2.5 微生物多樣性指數(shù)分析

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以用來估算樣品中微生物的多樣性，Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高;Simpson指數(shù)越大，說明群落多樣性越低[23]。由表3可知，S1.2號(hào)Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)最小;S3.2號(hào)Shannon指數(shù)最小，Simpson指數(shù)最大，說明S1.2號(hào)土樣的群落多樣性最高，S3.2號(hào)土樣的群落多樣性最低。

2.6 群落結(jié)構(gòu)分析

9 個(gè)土壤樣品高通量測(cè)序后共獲得14個(gè)門和未確定類群。如圖3所示，其中14個(gè)門分別屬于古菌域的泉古菌門（Crenarchaeota）和細(xì)菌域的酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、衣原體門（Chlamydiae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、OD1、浮霉菌門（Planctomycetes）、變形菌門（Proteobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、WS3。

經(jīng)分析，S1.3號(hào)樣品檢測(cè)到13個(gè)門，其他樣品均檢測(cè)到有14個(gè)門。在這些土壤中占優(yōu)勢(shì)的門有變形菌門（35.41%）、酸桿菌門（23.36%）和擬桿菌門（17.06%）。還有一些門相對(duì)豐度較低，有疣微菌門（9.21%）、硝化螺旋菌門（7.65%）和綠彎菌門（4.56%）;其余的門相對(duì)豐度非常低。恩施市雙河鎮(zhèn)、宜昌市五峰縣與常德市石門縣這3個(gè)取樣點(diǎn)土樣中占優(yōu)勢(shì)的門均為變形菌門;石門縣的土樣中的酸桿菌門相對(duì)豐度明顯高于雙河鎮(zhèn)和五峰縣的土樣，而變形菌門相對(duì)豐度明顯低于雙河鎮(zhèn)和五峰縣的土樣。3個(gè)地點(diǎn)的土壤中共有的菌門有泉古菌門、酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、衣原體門、綠彎菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門、OD1、浮霉菌門、變形菌門、疣微菌門和WS3。

3 討論

近年來，關(guān)于硒超積累植物中微生物的研究越來越多。2005年，Gregorio等[24]研究了硒超積累植物雙鉤黃芪（Astragalus bisulcatus），從其根際分離得到1株硒耐受型菌株 Stenotrophomonas maltophilia，該菌株能將Se4+還原為Se0。2015年，Staicu等[25]研究了另一種硒超積累植物沙漠王羽（Stanleya pinnata），從中分離出1株硒耐受性內(nèi)生菌Pseudomonas moraviensis，也能將Se4+還原為Se0，并能在48 h內(nèi)將790 mg/L的Se4+濃度降低到檢出限以下。同年，Sura-de Jong等[23]同樣對(duì)這2種硒超積累植物沙漠王羽和雙鉤黃芪做了細(xì)致研究，結(jié)果在2種植物的各個(gè)部位分離出多種硒超耐受性內(nèi)生菌，它們不僅也能將Se4+（亞硒酸鹽）還原為Se0，而且能將Se6+（硒酸鹽）還原為Se0，在含硒10 mg/L的高硒培養(yǎng)基中也能生長(zhǎng)。由此可見，很多耐硒菌可將亞硒酸鹽、硒酸鹽還原成單質(zhì)硒，形成硒蛋白復(fù)合物——膠體狀態(tài)紅色單質(zhì)硒，且在特定環(huán)境下可能具有生物活性[26]。

本試驗(yàn)研究了來自3個(gè)不同區(qū)域的堇葉碎米薺的根際土壤微生物，結(jié)果表明，3個(gè)區(qū)域的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門。2017年，袁林喜等[27]對(duì)湖北省恩施市壺瓶碎米薺（Cardamine hupingshanensis K.M.Liu， L.B.Chen， H.F.Bai & L.H.Liu）的根際微生物進(jìn)行了16S rRNA基因文庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)其根際微生物的優(yōu)勢(shì)菌群為α-變形菌綱、β-變形菌綱、放線菌綱、酸桿菌綱和γ-變形菌綱，在壺瓶碎米薺對(duì)硒的吸收中起重要作用的可能是α-變形菌綱和硝化螺旋菌綱，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致，不僅優(yōu)勢(shì)菌群有變形菌門，且根際微生物菌群中其他組成也大致相同。這可能是由于堇葉碎米薺的根際環(huán)境受高硒長(zhǎng)期影響，導(dǎo)致根際微生物菌群的組成相似。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)以往研究所發(fā)現(xiàn)的耐硒菌株均不是堇葉碎米薺根際微生物的優(yōu)勢(shì)菌群。

除此之外，很多專家學(xué)者對(duì)高硒地區(qū)的土壤微生物也作了研究。2018年， LIAO等[28]在廣西富硒土壤中分離出8株耐硒菌株，均能耐受10 000 μg/mL以上的硒濃度，其中，ylb1-33的硒耐受性最高，在硒濃度為29 000 μg/mL的固體培養(yǎng)基中仍能弱生長(zhǎng)，經(jīng)16S rDNA測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，YLB1-6鑒定為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），BMB2-1和TXB1-8鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），GPB2-5鑒定為蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），YLB1-26和YLB1-33被鑒定為地衣芽孢桿菌 ? ?（Bacillus licheniformis），YLB1-2和YFB1-8被鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）。因此，關(guān)于堇葉碎米薺生長(zhǎng)環(huán)境的土壤微生物的研究也有待深入，可進(jìn)一步分離純化后鑒定微生物菌種。

近年來，更多學(xué)者致力于研究植物的根際土壤微生物群落與植物的生長(zhǎng)或有效成分的積累等的相關(guān)性。2019年，李艷玲[29]研究了根際微生物群落對(duì)作物生長(zhǎng)及其調(diào)節(jié)因子的影響，發(fā)現(xiàn)多種化合物與植物或微生物的生長(zhǎng)代謝密切相關(guān);同年，盧玉秋[30]研究了微生物群落對(duì)作物生長(zhǎng)及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的影響，發(fā)現(xiàn)改變微生物群落結(jié)構(gòu)會(huì)影響玉米和水稻的生長(zhǎng)，同時(shí)，也會(huì)影響玉米和水稻根際植物體內(nèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子的種類和濃度。因此，關(guān)于堇葉碎米薺，可更深入地研究其根際微生物的群落種類及結(jié)構(gòu)與其生長(zhǎng)或富硒成分積累的相關(guān)性和作用機(jī)理，以期可以進(jìn)一步研究如何通過改變其根際微生物的群落種類及結(jié)構(gòu)來影響其生長(zhǎng)或富硒成分的積累。

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