葫蘆素B抑制JAK2/STAT3信號拮抗非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞增殖的研究

何臣 王菊輝 丘韶校 徐羽中 李元廣

【摘要】 目的：證明葫蘆素B通過影響JAK2/STAT3信號活化抑制非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）H1975細(xì)胞增殖。方法：采用不同濃度葫蘆素B作用于H1975細(xì)胞不同時(shí)間，采用CCK-8法測定細(xì)胞增殖抑制情況，采用PI染色法檢測細(xì)胞周期分布，采用Western blot法測定EGFR、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)。結(jié)果：葫蘆素B濃度10、100、1 000 nmol/L作用24、48 h的細(xì)胞增殖抑制率均高于葫蘆素B濃度0 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L>10 nmol/L（P<0.05）。葫蘆素B濃度10、100、1 000 nmol/L作用48 h的細(xì)胞增殖抑制率均高于作用24 h（P<0.05）。細(xì)胞增殖抑制率隨著葫蘆素B濃度增加和作用時(shí)間延長逐漸增高（P<0.05）。葫蘆素B濃度100、1 000 nmol/L作用24、48 h的G2/M期阻滯率均高于葫蘆素B濃度0、10 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L（P<0.05）。葫蘆素B濃度100、1 000 nmol/L作用48 h的G2/M期阻滯率均高于作用24 h（P<0.05）。G2/M期阻滯率隨著葫蘆素B濃度增加和作用時(shí)間延長逐漸增高（P<0.05）。葫蘆素B濃度100、1 000 nmol/L作用H1975細(xì)胞后p-STAT3與p-JAK2的表達(dá)均低于葫蘆素B濃度0、10 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L（P<0.05）。結(jié)論：葫蘆素B能夠抑制H1975細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期，其機(jī)制與葫蘆素B抑制JAK2/STAT3信號活化有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 非小細(xì)胞肺癌 葫蘆素B JAK2 STAT3

[Abstract] Objective： To demonstrate that Cucurbitacin B inhibits non-small cell lung cancer （NSCLC） H1975 cell proliferation by influencing JAK2/STAT3 signaling activation. Method： H1975 cells were treated with different concentrations of Cucurbitacin B at different time periods， cell proliferation inhibition was determined by CCK-8 method， cell cycle distribution was detected by PI staining， and protein expressions of EGFR， JAK2， and STAT3 were determined by Western blot. Result： The inhibition rate of cell proliferation at Cucurbitacin B concentrations of 10， 100 and 1 000 nmol/L for 24 and 48 h were higher than those at concentration of 0 nmol/L， of which 1 000 nmol/L > 100 nmol/L > 10 nmol/L （P<0.05）. The inhibition rate of cell proliferation at Cucurbitacin B concentrations of 10， 100 and 1 000 nmol/L for 48 h were higher than those of 24 h （P<0.05）. The inhibition rate of cell proliferation increased gradually with the increase of Cucurbitacin B concentration and the prolongation of action time （P<0.05）. The arrest rate of G2/M phase at Cucurbitacin B concentrations of 100 and 1 000 nmol/L for 24 and 48 h were higher than those at concentration of 0 and 10 nmol/L， in which 1 000 nmol/L > 100 nmol/L （P<0.05）. The arrest rate in G2/M phase at Cucurbitacin B concentrations of 100 and 1 000 nmol/L for 48 h were higher than those at 24 h （P<0.05）. The arrest rate of G2/M phase increased gradually with the increase of Cucurbitacin B concentrations and the prolongation of action time （P<0.05）. The expression of p-STAT3 and p-JAK2 in H1975 cells at Cucurbitacin B concentrations of 100 and 1 000 nmol/L were lower than those in H1975 cells at concentration of 0 and 10 nmol/L， of which 1 000 nmol/L>100 nmol/L （P<0.05）. Conclusion： Cucurbitacinacin B can inhibit the proliferation and cell cycle of H1975 cells， and its mechanism is related to the inhibition of JAK2/STAT3 signal activation by Cucurbitacin B.

[Key words] Non-small cell lung cancer Cucurbitacin B JAK2 STAT3

First-authors address： Shenzhen Baoan Peoples Hospital， Shenzhen 518101， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.26.008

肺癌是腫瘤相關(guān)死亡率和全球發(fā)病率較高的癌癥之一，在肺癌的所有類型中，80%以上是非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）[1]。NSCLC發(fā)病隱匿，早期臨床表現(xiàn)不典型，導(dǎo)致大多數(shù)NSCLC患者一經(jīng)診斷即已失去手術(shù)根治機(jī)會。近年來放化療、靶向治療以及免疫藥物治療的臨床應(yīng)用取得了一定的進(jìn)展，但NSCLC整體治療效果欠佳，5年相對存活率僅為23%，嚴(yán)重危害人類生命健康[2]。因此，尋找新的NSCLC治療靶點(diǎn)及藥物成為中晚期NSCLC治療中亟待解決的重要問題。

激活子3（STAT3）與轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子是激活子與轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子家族的重要成員，在肺癌等多種惡性腫瘤持續(xù)過度激活。持續(xù)活化的STAT3通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞自身抗凋亡和抑制機(jī)體正常免疫監(jiān)視、清除反應(yīng)導(dǎo)致腫瘤異常增殖和治療耐藥，因此阻斷STAT3信號的活化可能成為NSCLC新的治療途徑[3-11]。雖然基礎(chǔ)研究已經(jīng)展現(xiàn)了STAT3小分子、肽類和靶向沉默siRNA基因抑制劑的潛在臨床治療價(jià)值，但尚遠(yuǎn)未能進(jìn)入臨床常規(guī)應(yīng)用。

我國中醫(yī)學(xué)界運(yùn)用葫蘆素治療慢性肝病及肝癌已有很長的歷史，臨床藥用的葫蘆素片為葫蘆素B/E單體的復(fù)合制劑（其中葫蘆素B占60%）。近期國內(nèi)外的一些研究證實(shí)葫蘆素B能夠選擇性阻滯STAT3信號通路活化，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤活性[12-19]。因此，在本研究中通過觀察各種濃度葫蘆素B分別作用不同時(shí)間對人肺腺癌細(xì)胞（H1975細(xì)胞）的影響，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及STAT3信號分子活化，旨在證明葫蘆素B對NSCLC的治療作用及機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人肺癌細(xì)胞株H1975購自美國國家細(xì)胞庫（ATCC）;RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）;葫蘆素B（美國Sigma公司）;CCK-8檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)株式會社）;BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）;抗人磷酸化及總EGFR、JAK2、STAT3抗體（美國Cell Signaling公司）;二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Hera-eus公司）;酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystem公司）;垂直電泳儀（美國Biorad公司）;KONDA2000凝膠成像系統(tǒng)（美國Eastman Kodak公司）。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期H1975細(xì)胞，采用胰酶消化制成濃度為3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液100 μL/孔，觀察細(xì)胞貼壁后加入不同濃度（終濃度分別為0、10、1 000、1 000 nmol/L）的葫蘆素B，各濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48 h后在96孔培養(yǎng)板中加入CCK-8溶液，20 μL/孔，孵育2 h，在酶標(biāo)儀上450 nm處檢測OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=（1-OD加藥-本底/OD未加藥-本底）×100%[20]。

1.2.2 PI染色法檢測細(xì)胞周期分布 取對數(shù)生長期H1975細(xì)胞，采用胰酶消化制成濃度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，在6孔板中接種細(xì)胞懸液2 mL/孔，觀察細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的葫蘆素B（終濃度分別為0、10、1 000、1 000 nmol/L），均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48 h后，取細(xì)胞懸液1 mL離心、清洗、4 ℃固定過夜、清洗、離心，加入100 mg/mL的PI染液500 μL，其中RNA酶的濃度為50 μg/ml;避光染色，采用Multicycle軟件進(jìn)行G2/M期阻滯率分析。

1.2.3 Westem blot法檢測EGFR、JAK2及STAT3蛋白的表達(dá)情況 取對數(shù)生長期H1975細(xì)胞，采用胰酶消化制成濃度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，在10 cm培養(yǎng)基上接種細(xì)胞懸液10 mL，觀察細(xì)胞生長至80%時(shí)，采用含不同濃度葫蘆素B（終濃度分別為0、10、1 000、1 000 nmol/L）的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用Westem blot法檢測總EGFR、JAK2與STAT3蛋白表達(dá);應(yīng)用KONDA2000凝膠成像系統(tǒng)成像，使用圖像分析軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用SNK檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 葫蘆素B對H1975細(xì)胞增殖的抑制作用 葫蘆素B濃度10、100、1 000 nmol/L作用24、48 h的細(xì)胞增殖抑制率均高于葫蘆素B濃度0 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L>10 nmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。葫蘆素B濃度10、100、1 000 nmol/L作用48 h的細(xì)胞增殖抑制率均高于作用24 h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。細(xì)胞增殖抑制率隨著葫蘆素B濃度增加和作用時(shí)間延長逐漸增高（P<0.05）。見表1。

2.2 濃度不同的葫蘆素B作用對H1975細(xì)胞周期分布的影響 葫蘆素B濃度100、1 000 nmol/L作用24、48 h的G2/M期阻滯率均高于葫蘆素B濃度0、10 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。葫蘆素B濃度100、1 000 nmol/L作用48 h的G2/M期阻滯率均高于作用24 h，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。G2/M期阻滯率隨著葫蘆素B濃度增加和作用時(shí)間延長逐漸增高（P<0.05）。見表2。

2.3 不同濃度葫蘆素B對H1975細(xì)胞JAK2、STAT3、EGFR蛋白表達(dá)的影響 葫蘆素B濃度100、1 000 nmol/L作用H1975細(xì)胞后p-STAT3與p-JAK2的表達(dá)均低于葫蘆素B濃度0、10 nmol/L，其中1 000 nmol/L>100 nmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同濃度葫蘆素B濃度作用H1975細(xì)胞后對p-EGFR、EGFR、JAK2以及STAT3蛋白表達(dá)無明顯的影響（P>0.05）。見表3和圖1。

3 討論

葫蘆素是長期廣泛應(yīng)用的抗炎保肝中草藥成分。文獻(xiàn)[18，21]均分別發(fā)現(xiàn)葫蘆素B及其半合成衍生物DACE能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖、G2/M細(xì)胞周期抑制，其作用機(jī)制是通過抑制STAT3蛋白的激活實(shí)現(xiàn)。目前國內(nèi)外研究結(jié)果表明，葫蘆素B對STAT3分子磷酸化有很強(qiáng)的阻斷作用，并且能夠抑制腫瘤活性[13-19]。本研究結(jié)果顯示，葫蘆素B呈劑量和時(shí)間依賴性抑制H1975細(xì)胞的細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G2/M期;進(jìn)一步的免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)100 nmol/L濃度以上葫蘆素B作用后H1975細(xì)胞后磷酸化STAT3的表達(dá)明顯受抑制。說明葫蘆素B能夠抑制細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞周期分布，使相應(yīng)細(xì)胞周期停滯于G2/M期，細(xì)胞增殖受抑，從而能夠抑制腫瘤的生長和進(jìn)一步發(fā)展，與近年來國內(nèi)外同類型的研究結(jié)論相同。

單體的STAT3分子無活性，可通過受體或非受體通路依賴兩種經(jīng)典途徑活化，活化后的STAT3分子形成二聚體，其能夠迅速進(jìn)入細(xì)胞核，然后與特定的DNA結(jié)合，從而調(diào)控相應(yīng)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能。第一種途徑為可通過直接活化自身酪氨酸殘基的活化途徑，這種活化是需要經(jīng)過具有自身酪酸激酶活性的EGFR等受體與配體結(jié)合后進(jìn)行;第二種途徑為通過募集激活JAK家族成員的活化途徑，需要與相應(yīng)的配體結(jié)合后從而募集激活JAK家族成員，然后通過JAK激酶的作用，激活STAT3。本研究采用免疫印跡法檢測不同濃度的葫蘆素B作用H1975細(xì)胞后，H1975細(xì)胞的磷酸化及總JAK2、EGFR蛋白的表達(dá)與既往報(bào)道文獻(xiàn)[22]類似，本研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)100 nmol/L濃度以上葫蘆素B處理后H1975細(xì)胞p-JAK2信號激活產(chǎn)生不同程度的抑制作用，這種抑制與p-STAT3信號激活相關(guān)，表現(xiàn)為正相關(guān);而對H1975細(xì)胞的p-EGFR及總EGFR蛋白的表達(dá)不明顯，說明葫蘆素B影響H1975細(xì)胞的機(jī)制與細(xì)胞的JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受抑制緊密相關(guān)，而這種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是EGFR非依賴性的。

綜上所述，葫蘆素B在靶向抑制JAK2/STAT3信號通路中具有強(qiáng)大的藥理學(xué)作用，其機(jī)制是通過葫蘆素B的信號分子導(dǎo)航選擇性抑制人非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞中異常活化的STAT3的信號傳導(dǎo)，介導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌H1975細(xì)胞細(xì)胞增殖抑制和G2/M細(xì)胞周期阻滯，然后發(fā)揮抗腫瘤作用，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的選擇。

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（收稿日期：2020-02-28） （本文編輯：田婧）