鴨疫里默氏桿菌和副粘病毒混合感染的診斷

羅玲　李麗　汪宏才　溫國(guó)元　羅青平　王紅琳　盧琴　商雨　邵華斌　王孝忠

摘要：2019年7月，湖北省某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的10 000只鴨暴發(fā)疫病，引起大量死亡，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)診斷和病毒學(xué)診斷，確診為鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）和副粘病毒混合感染。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）;副粘病毒;混合感染;診斷

中圖分類號(hào)：S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020） 16-0115-03

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.025

鴨疫里默氏桿菌病是危害全世界養(yǎng)鴨業(yè)一種重要的水禽細(xì)菌性疾病，是由鴨疫里默氏桿菌（Rieme-rella anatipestifer）引起家鴨、火雞、鵝和其他禽類的一種接觸性傳染病，又名鴨傳染性漿膜炎。該病呈急性或慢性敗血癥形式，其特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎、干酪性輸卵管炎等，發(fā)病率和死亡率很高，易產(chǎn)生耐藥性，且血清型眾多，給該病的防治工作帶來(lái)很大困難，已對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。鴨副粘病毒病是危害全世界養(yǎng)鴨業(yè)的一種重要病毒病，沒有明顯的流行季節(jié)，發(fā)病后病鴨并非立即死亡，而是混合或繼發(fā)感染其他病毒病或細(xì)菌病，使鴨群的病情加重，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，養(yǎng)殖場(chǎng)病毒病混合或繼發(fā)感染細(xì)菌病已成普遍現(xiàn)象，增加了疾病診斷和防控難度。

2019年7月，湖北省某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的10000只麻鴨暴發(fā)疫病，引起大量死亡，發(fā)病后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為鴨疫里默氏桿菌和副粘病毒混合感染，經(jīng)治療病情得到了控制。現(xiàn)將病鴨群的疾病診斷及防治情況報(bào)道如下。

1發(fā)病情況

該養(yǎng)殖戶為個(gè)體養(yǎng)殖戶，共飼養(yǎng)10000只地方麻鴨，圈養(yǎng)，2019年7月初鴨群突然發(fā)病，發(fā)病時(shí)鴨只25日齡，發(fā)病后立即投喂氟苯尼考和阿莫西林等藥物后無(wú)明顯效果，每天死亡200多只。

2 臨床癥狀

發(fā)病鴨群精神萎靡，食欲下降或不食，共濟(jì)失調(diào)，糞便呈水樣，泄殖腔周圍被糞便污染，部分病鴨出現(xiàn)頭頸歪斜等神經(jīng)癥狀，部分鴨出現(xiàn)張口呼吸、甩頭等呼吸道癥狀。

3病理剖檢

送檢鴨主要剖檢病變是心包和肝臟表面均覆蓋一層灰白色的纖維素膜，氣囊有纖維素滲出性炎癥，腎臟腫大并有尿酸鹽沉積，部分鴨腺胃出血、腦出血和充血，其他組織無(wú)肉眼可見病變。

4實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1 細(xì)菌學(xué)診斷

1） 細(xì)菌分離培養(yǎng)。無(wú)菌采集病鴨的腦組織直接劃線接種于含5%小牛血清的TSA培養(yǎng)基上，置于燭缸中37 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取圓形隆起、光滑的菌落接種于含5%小牛血清的TSA、麥康凱瓊脂平板和TSB培養(yǎng)基，燭缸中37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察培養(yǎng)結(jié)果，染色、鏡檢。

2） 生化試驗(yàn)。將臨床分離菌的TSB純培養(yǎng)物分別接種到葡萄糖、蔗糖、棉子糖、吲哚、硫化氫、硝酸鹽、M.R、V-P、明膠液化和觸酶10種生化管進(jìn)行生化試驗(yàn)。

3） 藥敏試驗(yàn)。選擇頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢噻吩、頭孢噻肟、阿米卡星、萘啶酸、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、依諾沙星、左氟沙星、氟苯尼考、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿莫西林15種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，試驗(yàn)方法按照世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的Kirby-Baure法進(jìn)行[2]。

4） PCR擴(kuò)增鑒定。針對(duì)鴨疫里默氏桿菌camp基因設(shè)計(jì)合成引物，引物序列如下：上游引物5'-CTAGGATCCGTAAGTGGTGGGCATACA-3'，下游引物 5'-TCGAAGCTTATCTTGCAGTAGCCGTTG-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為610 bp。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照羅玲等[3，4]方法進(jìn)行。將37℃培養(yǎng)的臨床分離菌株進(jìn)行PCR鑒定，PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

4.2病毒學(xué)診斷

1） 病料處理。無(wú)菌采集病鴨的肺臟和氣管等組織1g于2mL離心管中，加入含1%雙抗的PBS溶液，組織勻漿15 min，反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清備用。

2） 病毒分離。取上述組織上清液接種9～11日齡的雞胚，收集24 h后死亡雞胚及5 d后未死亡雞胚尿囊液。

3） 病毒RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。取上述處理的組織上清液和雞胚尿囊液分別提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。RNA提取方法按照AXYGEN Viral RNAExtraction Kit Ver. 5.0試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄體系：反應(yīng)總體積為20μL，組成如F：5×Hiscript酶5 μL，RNA 模板 8μL，H20 7μL，混勻，55℃作用 15min，85℃ 5s〇

4） 引物設(shè)計(jì)合成。參考GenBank上已發(fā)表的NDV F基因序列設(shè)計(jì)，上游引物5'-ATGGGCTC-CAGACCTTCTAC-3'，下游引物：5'-ACTGCTAGTT-GCGATAATCCG TCAG-3'，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成，片段大小為530 bp。

5） RT-PCR擴(kuò)增鑒定。將獲得的cDNA進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)總體積為25μL，包括：2×Taq DNA聚合酶 12.5 μL，cDNA 2 μL，兩條 PCR 引物各 1 μL，加超純水8.5μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性 10 s，55℃ 退火 10 s，72 ℃ 延伸 10 s，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，并將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

5診斷結(jié)果

5.1 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果

細(xì)菌分離結(jié)果：分離菌在TSA中培養(yǎng)24 h后，形成圓形凸起、邊緣整齊、透明、有光澤、呈奶油狀的小菌落;分離菌在TSB中培養(yǎng)24 h后液體渾濁;分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng);分離菌革蘭氏染色為陰性、短小桿菌，單個(gè)或成雙存在，少數(shù)呈鏈狀排列。