四種培養(yǎng)基對(duì)大麗輪枝菌V991b及突變體的影響

黃薇　袁斌　金利容　楊小林　張瑞洋　萬(wàn)鵬

摘要：為了解黃萎病菌V991b及其突變體V991w的生物學(xué)特性和致病力，調(diào)查了不同條件培養(yǎng)基對(duì)2種病原菌的生長(zhǎng)及致病力的影響。結(jié)果表明，2種病原菌的生長(zhǎng)曲線基本呈線性。V991b在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率與其他培養(yǎng)基之間差異顯著，其他3種培養(yǎng)基之間差異不顯著;V991w在PDA和PCA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率之間差異不顯著，與其他兩種培養(yǎng)基之間差異顯著。接種于PDA培養(yǎng)基15d后，V991b與V991w的菌落生長(zhǎng)直徑之間無(wú)顯著差異。經(jīng)查氏液體培養(yǎng)基搖菌后接種棉苗，25d時(shí)V991b和V991w的致病力分別為56.63和23.23，而經(jīng)查氏-棉葉組織液體培養(yǎng)基搖菌后接種棉苗，其病情指數(shù)明顯降低，接種25d時(shí)V991b和V991w的病指僅為12.12和7.32。棉葉組織培養(yǎng)基對(duì)大麗輪枝菌微菌核的直徑生長(zhǎng)無(wú)顯著影響，但對(duì)微菌核的數(shù)量和菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。

關(guān)鍵詞：黃萎病;培養(yǎng)性狀;生長(zhǎng)速率;菌落直徑;致病力

中圖分類號(hào)：S43 2.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020） 16-0078-07

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.016

大麗輪枝菌（Verticillium Kleb.）是一種土傳性的病原菌，其寄主范圍廣，在世界范圍內(nèi)都造成了不同程度的危害，且還在逐年擴(kuò)大[1]。該病原菌的變異程度高，產(chǎn)生的微菌核抗逆性強(qiáng)，在土壤中可存活10年以上，且一旦定殖就很難清除掉，目前由于缺乏有效的抗病品種，土壤中微生物生態(tài)的失衡、肥料的濫用、大氣環(huán)境的變化等多方面的影響，大麗輪枝菌上升成了棉花上的一種主要病害，在中國(guó)的棉區(qū)都存在著較大的影響[2，3]。由于黃萎病菌的形態(tài)和致病力容易發(fā)生變異，不同地區(qū)和來(lái)源的病原菌之間差異較大，甚至在同一塊棉田中黃萎病菌的致病力也存在分化，已有研究表明長(zhǎng)江流域的棉花黃萎病菌培養(yǎng)性狀變化最大[4]，近年來(lái)研究重心從調(diào)查不同地區(qū)的致病力分型和分化上逐漸向侵染機(jī)制上轉(zhuǎn)變，但對(duì)病原菌在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)產(chǎn)生變異的原因尚無(wú)定論。Puhalla[5]認(rèn)為紫外線會(huì)對(duì)病原菌產(chǎn)生誘變，前人研究[6-8]認(rèn)為光照、溫度等環(huán)境條件對(duì)輪枝菌微菌核的形成有一定的影響，32℃以上不能形成微菌核，添加黑色素外源的中間產(chǎn)物[9，10]處理也可以對(duì)病原菌的形態(tài)產(chǎn)生顯著影響。但對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)條件下病原菌及其突變體生物學(xué)特性等方面的研究較少，本試驗(yàn)從不同條件的培養(yǎng)基入手，以V991b及其突變體V991w為研究對(duì)象，調(diào)查病原菌的培養(yǎng)特性和顯微結(jié)構(gòu)，并從生長(zhǎng)速率和苗期接種等方面探討其致病力發(fā)生改變的原因。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試菌株 野生型V991b為菌核型菌株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);V991w為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所棉花病害實(shí)驗(yàn)室在PDA培養(yǎng)條件下從V991b菌落中分離得到的突變體，為菌絲型菌株，每2周繼代1次，用5mm打孔器于菌落外緣生長(zhǎng)旺盛的區(qū)域打取菌餅，其性狀經(jīng)過(guò)多次繼代后可穩(wěn)定遺傳。

1.1.2 鑒別寄主 鑒別寄主均為常規(guī)棉，其中，冀棉11為感病品種，豫棉2067為耐病品種，魯棉28為抗病品種。各品種種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所朱荷琴老師惠贈(zèng)，在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所繁育所得。

1.1.3 棉花種植及接種 棉花種子經(jīng)硫酸脫絨和雙氧水表面消毒后，置于平皿中以無(wú)菌水浸泡1～2 h。種子泡好后，采用無(wú)土基質(zhì)來(lái)育苗。育苗基質(zhì)與過(guò)篩后的河沙以重量比1：1攪拌均勻，用大方盒適量分裝備用。將棉花種子播種到浸潤(rùn)均勻的基質(zhì)中，分行播種。保持濕度，保證溫室自然通風(fēng)，勤加管理。使室溫保持在22～28℃，待棉苗長(zhǎng)至2～3片真葉時(shí)采用裸苗傷根法接種病原菌[11]。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

1）PDA培養(yǎng)基。PDA培養(yǎng)基的制作參照《植病研究方法》[12]。

2） PCA培養(yǎng)基。PCA液體培養(yǎng)基的制作同PDA培養(yǎng)基，但去掉瓊脂粉15g，定容分裝備用。

3） 水瓊脂培養(yǎng)基。瓊脂粉15g，加熱溶化瓊脂后用紗布過(guò)濾，定容補(bǔ)齊至1000 mL，121℃滅菌20 min 。

4） 棉葉組織培養(yǎng)基。各個(gè)棉花品種于室內(nèi)26～?28℃條件下育苗，濕度70%，光照：黑暗12 h： 12h，先在淺口托盤中播種，待剛長(zhǎng)出2片子葉后移栽，每缽移栽4～5顆棉苗，待第4片真葉完全展平后，作為試驗(yàn)材料取樣，棉葉及棉柄作為一組，棉花莖部組織及根部組織作為一組，分別稱鮮重。稱重后在葉片部分加入干冰隔毛巾碎樣，使樣品完全粉碎而干冰仍有剩余為佳，整個(gè)過(guò)程使葉片組織完全處于低溫干燥狀態(tài)。碎樣后放入-80℃冰箱保存待用。稱取瓊脂粉15g，煮沸至溶化，加入20 g葉片組織，稍加攪拌，以雙層紗布過(guò)濾，定容至1000 mL。121℃滅菌20 min。

5） 查氏培養(yǎng)基。查氏培養(yǎng)基的制作參照《植病研究方法》[12]。

6） 查氏-棉葉組織液體培養(yǎng)基。制作1 000 mL的查氏培養(yǎng)基，加入20g葉片組織，稍加攪拌，以雙層紗布過(guò)濾，定容至1000mL分裝備用后，121℃滅菌20 min。

1.2.2 病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)及菌落形態(tài)的觀察 將純化培養(yǎng)后的V991b和V991w用5mm的打孔器打出菌餅，分別接種于4種培養(yǎng)基平皿上，在（25±1）℃條件下恒溫培養(yǎng)15 d，分別觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和菌落特征。

1.2.3 生長(zhǎng)速率的測(cè)定 選取純化培養(yǎng)后的大麗輪枝菌，從供試菌株的菌落邊緣取直徑2～3 mm的菌絲塊，分別接種到PDA、水瓊脂培養(yǎng)基、棉葉組織培養(yǎng)基和PCA培養(yǎng)基的平皿中央，于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。用十字交叉法每隔1d測(cè)定菌落直徑，并計(jì)算生長(zhǎng)速率，直至接種后15d。

1.2.4 微菌核數(shù)量和直徑 每皿分別吸取100μL濃度為1×l06CFU/mL V991b和V991w菌株的分生孢子懸浮液均勻涂布于培養(yǎng)基平板上，置于（25±1）℃恒溫培養(yǎng)10d，每個(gè)處理3次重復(fù)，并記錄微菌核產(chǎn)生的時(shí)間。

使用40倍倒置M微鏡（Olympus IX-81，Nikon）統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下微菌核的數(shù)量。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)統(tǒng)計(jì)30個(gè)視野下的微菌核數(shù)量，并求出平均數(shù)。使用倒置顯微鏡（Olympus IX-81，Nikon）在100倍條件下，隨機(jī)測(cè)量每個(gè)重復(fù)100個(gè)微菌核的長(zhǎng)和寬，計(jì)算長(zhǎng)和寬的平均值作為微菌核直徑的代表值。從供試菌株的菌落邊緣取且徑2～3mm的菌絲塊，分別接種到PDA、水瓊脂培養(yǎng)基、棉葉組織培養(yǎng)基和PCA培養(yǎng)基的平皿中央，于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，4次重復(fù)，每隔1d采用十字交叉法調(diào)查菌落直徑，直至接種后15 d。

在直徑為90mm的培養(yǎng)皿中每皿倒入15mL培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)基分別標(biāo)記，接入孢子液。倒置靜置，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，并記錄微菌核產(chǎn)生的時(shí)間。

1.2.5 病原菌致病力測(cè)定 將待測(cè)菌株接種到查氏培養(yǎng)液中，于25℃條件下180 r/min搖菌7d，獲得菌懸液，經(jīng)過(guò)雙層濾紙真空抽濾，配制成濃度為5×106CFU/mL的孢子懸液。將棉花品種經(jīng)無(wú)土基質(zhì)育苗后移栽到直徑為15 cm的營(yíng)養(yǎng)缽中，待2～3片真葉展平后，采用浸根法接種。接種前將棉苗慢慢托起，不致大量傷根和傷苗。每個(gè)品種至少取60棵苗，將3個(gè)鑒別品種分開標(biāo)記，保持根部基本整齊一致，然后置于同一菌系的菌懸液中，使根能夠充分接觸到菌液。裸苗浸根接種30min后移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中。每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中4～5株棉苗，置于22～28℃溫室中自然通風(fēng)培養(yǎng)，精心管理[11]。

1.2.6 不同培養(yǎng)基對(duì)微菌核產(chǎn)生的影響 將2種病原菌的孢子液分別接種于PDA培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基和棉葉組織培養(yǎng)基上，置于25℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每個(gè)溫度處理重復(fù)3皿，靜置培養(yǎng)20d后，置于倒置顯微鏡下觀察，并記錄微菌核數(shù)量、長(zhǎng)度、直徑等參數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用DPS的單因素方差和Dimcan's新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)的多重比較分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)及培養(yǎng)15d菌落直徑的生長(zhǎng)曲線

2.1.1 接種15 d PDA培養(yǎng)基上V991b和V991w的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)曲線由圖1可以看出，在PDA培養(yǎng)基上，V991b和V991w菌落形態(tài)特征差異非常顯著，V991b為菌核型菌落，微菌核多，菌落背面呈黑色，菌落表面氣生菌絲少;V991w為菌絲型菌落，無(wú)微菌核，菌落背面呈白色，菌落表面氣生菌絲茂密。兩者的菌落外觀迥異。在接種15d內(nèi)菌落生長(zhǎng)曲線呈線性關(guān)系。

2.1.2 接種15 d水瓊脂培養(yǎng)基上V991b和V991w的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)曲線 由圖2可以看出，在水瓊脂培養(yǎng)基上，V991b和V991w的菌落形態(tài)特征與在PDA培養(yǎng)基上類似，但菌落表面的氣生菌絲茂密程度明顯下降，氣生菌絲稀疏分布在菌落表面，V991b仍然有著肉眼可見的黑色素，是糾結(jié)成團(tuán)的微菌核;V991w無(wú)微菌核，是白色的菌絲型菌落，兩者菌落特征差異明顯。接種15 d內(nèi)菌落生長(zhǎng)曲線呈線性關(guān)系。

2.1.3 接種15d棉葉組織培養(yǎng)基上V991b和V991w的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)曲線 由圖3可以看出，在棉葉組織培養(yǎng)基上，V991b和V991w平皿上的形態(tài)非常相似，但V991b的微菌核四處分散，氣生菌絲少。鏡檢發(fā)現(xiàn)其氣生孢子多，輪枝狀結(jié)構(gòu)典型且清晰，4、5個(gè)孢子叢生，產(chǎn)孢量高于V991w;V991w無(wú)微菌核，氣生菌絲少，主要集中在菌餅處，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲占大多數(shù)，輪枝狀結(jié)構(gòu)少，氣生孢子相對(duì)來(lái)說(shuō)較少。接種15 d內(nèi)菌落生長(zhǎng)曲線基本呈線性關(guān)系。

2.1.4 接種15d PCA培養(yǎng)基上V991b和V991w的菌落形態(tài)和生長(zhǎng)曲線 由圖4可以看出，在PCA培養(yǎng)基上，V991b和V991w的菌落形態(tài)特征與在PDA培養(yǎng)基上類似，菌落表面的氣生菌絲稀疏分布在菌落表面，V991b仍為黑色菌核型，V991w為白色菌絲型，菌落特征差異明顯。接種15d內(nèi)菌落生長(zhǎng)曲線基本上呈線性關(guān)系。

2.2 對(duì)病原菌生長(zhǎng)速率的測(cè)定

由表1可知，V991b在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率與其他培養(yǎng)基之間差異顯著，而其他3種培養(yǎng)基之間差異不顯著;7～15d V991w在PDA培養(yǎng)基與PCA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率差異不顯著，而與其他2種培養(yǎng)基之間差異顯著。接種到PDA培養(yǎng)基上，V991b和V991w接種15d后的菌落直徑無(wú)顯著差異，但在靜置培養(yǎng)過(guò)程中，V991b與V991w的生長(zhǎng)速率有差異，在接種后0～7 d，V991b的生長(zhǎng)速率高于V991w，而在接種后7～15 d， V991b的生長(zhǎng)速率低于V991w。將V991b和V991w接種到PCA培養(yǎng)基和棉葉組織培養(yǎng)基上時(shí)，也出現(xiàn)類似情況。僅接種到水瓊脂培養(yǎng)基上，在靜置培養(yǎng)的15d內(nèi)，V991b生長(zhǎng)速率始終明顯高于V991w，而最終的菌落生長(zhǎng)直徑V991b也明顯大于V991w。

2.3 不同類型培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌落直徑的影響

由表2可以看出，不同培養(yǎng)基條件下，接種15d后V991b和V991w的菌落直徑差異不顯著。接種到PDA培養(yǎng)基上，15d后V991b和V991w的菌落直徑分別為5.27cm和5.37cm;接種到PCA培養(yǎng)基上，15d后V991b和V991w的菌落直徑分別為5.35cm 和4.93cm; 接種到棉葉培養(yǎng)基上，15d后V991b和V991w的菌落直徑分別為5.20cm和5.48cm;接種至水瓊脂培養(yǎng)基上，菌落直徑最低，15d后V991b和V991w菌落直徑分別為4.83cm和4.13cm。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌形態(tài)特征和顯微結(jié)構(gòu)的影響

如圖5所示，在PDA培養(yǎng)基上，V991b和V991w的形態(tài)特征差異非常明顯，V991b為菌核型菌落，菌落表面氣生菌絲少，微菌核和分生孢子多;而V991w為菌絲型菌落，菌落表面氣生菌絲茂密，顯微結(jié)構(gòu)以菌絲為主，菌落外觀迥異。PCA培養(yǎng)基和水瓊脂培養(yǎng)基上，V991b和V991w的菌落形態(tài)特征與PDA培養(yǎng)基上類似，而菌落表面的氣生菌絲茂密程度明顯下降，氣生菌絲稀疏分布在菌落表面，V991b和V991w的菌落特征仍然非常明顯。在棉花組織培養(yǎng)基上，V991b和V991w平皿上的形態(tài)非常相似，但V991b的產(chǎn)孢量高于V991w，氣生孢子多，輪枝狀結(jié)構(gòu)典型且清晰，4、5個(gè)孢子叢生，微菌核四處分散。放大400倍[13]后發(fā)現(xiàn)，微菌核為多個(gè)厚壁的黑色細(xì)胞集結(jié)形成，糾結(jié)成團(tuán)，在外緣有部分呈半透明狀的細(xì)胞。V991w的氣生孢子較少，稀疏分布，鏡檢表明菌絲占大多數(shù)，氣生孢子相對(duì)來(lái)說(shuō)較少，輪枝狀結(jié)構(gòu)少，無(wú)微菌核。

2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)微菌核產(chǎn)生的影響

以棉花葉片組織為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源的培養(yǎng)基上，25℃條件下，黑暗靜置培養(yǎng)3～4d即出現(xiàn)了肉眼可見的黑色素;在PDA培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)6～7d才出現(xiàn)相同情況，而在PCA培養(yǎng)基上約36h即出現(xiàn)肉眼可見的黑色素。在水瓊脂培養(yǎng)基上6～7 d才出現(xiàn)微菌核。由表3可知，在PDA培養(yǎng)基上微菌核的長(zhǎng)度最大，平均長(zhǎng)度為62.975μm，視野內(nèi)微菌核的數(shù)量也較多，平均數(shù)量為245.2個(gè);在PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)生的微菌核數(shù)量最多，平均數(shù)量可達(dá)377.3個(gè)，PCA培養(yǎng)基有利于微菌核的產(chǎn)生，但其長(zhǎng)度在4種培養(yǎng)基中最短，平均長(zhǎng)度僅有20.682 μm。棉葉培養(yǎng)基不利于微菌核的產(chǎn)生，得到的微菌核數(shù)量最少，與菌落表型基本對(duì)應(yīng)。

2.6 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌致病力的影響

根據(jù)病指調(diào)查結(jié)果顯示，以棉葉組織培養(yǎng)基搖出的病原菌致病力明顯低于查氏液體培養(yǎng)基搖出的病原菌，V991b和V991w平均病指分別為12.12和7.32。而經(jīng)查氏液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后接種棉苗，V991b的平均病指為56.63， V991w的平均病指為23.23。在查氏液體培養(yǎng)基中加入棉葉后搖菌接種，兩種病原菌的病情指數(shù)均有下降，分別是51.10和17.38。說(shuō)明棉葉組織培養(yǎng)基可能會(huì)影響病原菌的生長(zhǎng)。在4種培養(yǎng)基中，菌核型V991b的病情指數(shù)均高于菌絲型V991w的病情指數(shù)。

3討論

3.1病原菌的生長(zhǎng)曲線基本呈線性關(guān)系

經(jīng)測(cè)定病原菌的生長(zhǎng)直徑發(fā)現(xiàn)，2種病原菌的生長(zhǎng)曲線基本呈線性關(guān)系，與湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所棉花病害實(shí)驗(yàn)室不同來(lái)源病原菌的調(diào)查結(jié)果類似，生長(zhǎng)速率大多也呈線性關(guān)系。除了水瓊脂培養(yǎng)基外，其他3種培養(yǎng)基上都是接種后7d，V991b的生長(zhǎng)速率高于V991w;接種后15d，V991b的生長(zhǎng)速率一般低于V991w，可能是接種前期V991b的菌絲生長(zhǎng)速率更快。僅在水瓊脂培養(yǎng)基上，15d內(nèi)V991b生長(zhǎng)速率始終高于V991w，導(dǎo)致最終的菌落生長(zhǎng)直徑V991b也明顯大于V991w。

不同類型的培養(yǎng)基對(duì)病原菌的生長(zhǎng)速度有影響，V991b在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率與其他3種培養(yǎng)基上有顯著差異;而V991w在PDA培養(yǎng)基和PCA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率差異不顯著，而與其他2種培養(yǎng)基上的差異顯著。接種15d后，2種病原菌在水瓊脂培養(yǎng)基上的菌落直徑均顯著小于其他3種培養(yǎng)基。表明菌落的生長(zhǎng)速率和菌落直徑與營(yíng)養(yǎng)條件有關(guān)，在接入平皿前期，營(yíng)養(yǎng)條件越豐富，菌落的生長(zhǎng)速率越快。在靜置培養(yǎng)條件下，棉葉組織培養(yǎng)基不影響菌絲的伸長(zhǎng)，俞燕等[14]認(rèn)為不同碳氮比營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)大麗輪枝菌的產(chǎn)孢能力和菌絲生長(zhǎng)有影響，低碳氮比有利于大麗輪枝菌的產(chǎn)孢和菌絲生長(zhǎng)，本試驗(yàn)結(jié)果與之類似。

3.2大麗輪枝菌微菌核出現(xiàn)的早晚可能與營(yíng)養(yǎng)成分密切相關(guān)

楊家榮等[15]發(fā)現(xiàn)微菌核在偏堿性的條件下更容易產(chǎn)生。測(cè)定4種培養(yǎng)基的pH發(fā)現(xiàn)，水瓊脂培養(yǎng)基最高，PCA培養(yǎng)基次之，PDA培養(yǎng)基最低。PCA培養(yǎng)基中微菌核的產(chǎn)生時(shí)間先于PDA培養(yǎng)基和棉葉組織培養(yǎng)基，水瓊脂培養(yǎng)基的pH最接近7.0，但其營(yíng)養(yǎng)成分最低，微菌核出現(xiàn)的時(shí)間最晚。培養(yǎng)條件的pH可能會(huì)影響微菌核出現(xiàn)的時(shí)間，但更與培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)。

前人研究將黃萎病菌按菌落特性分為菌核型、菌絲型和中間型三大類[4，16]。以PDA培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)時(shí)，菌核型菌落會(huì)出現(xiàn)退化現(xiàn)象，表現(xiàn)為菌落背面僅有少量微菌核，菌落正面的氣生菌絲明顯減少，培養(yǎng)2周內(nèi)菌落特征趨向中間型，但靜置培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)1個(gè)月后，其仍表現(xiàn)為菌核型。多次繼代培養(yǎng)的菌核型菌株有向中間型轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，若將退化的菌株轉(zhuǎn)入PCA培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是有大量微菌核的類型還是只有少量微菌核的類似中間型都很快轉(zhuǎn)化為黑色菌核型，大約2d就會(huì)出現(xiàn)明顯黑色素;而菌絲型的培養(yǎng)形態(tài)無(wú)改變。大麗輪枝菌的微菌核作為一種抗逆性結(jié)構(gòu)，用來(lái)抵御不良環(huán)境對(duì)病原菌的影響，白應(yīng)文等[17]發(fā)現(xiàn)將BM培養(yǎng)基中葡萄糖的用量減半，并在培養(yǎng)基表面覆蓋玻璃紙可使大麗輪枝菌微菌核產(chǎn)量提高。那么在營(yíng)養(yǎng)優(yōu)越的條件下，微菌核的產(chǎn)生可能會(huì)下降。而在PCA培養(yǎng)基上，氣生菌絲體的生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)量少但很健康。這與《植病研究方法》中的結(jié)論一致[12]。

3.3 不同營(yíng)養(yǎng)條件影響病原菌微菌核的數(shù)量和直徑

病原菌微菌核的直徑和數(shù)量與培養(yǎng)基的條件有關(guān)，營(yíng)養(yǎng)條件不同會(huì)影響病原菌微菌核的數(shù)量，白應(yīng)文[18]認(rèn)為大麗輪枝菌微菌核的數(shù)量及大小與pH、溫度等因素有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基顯著影響菌落表面的氣生菌絲，營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上氣生菌絲茂密，分生孢子和微菌核顯著多于營(yíng)養(yǎng)條件較低的培養(yǎng)基，前者形成的氣生菌落更致密，典型的輪紋狀結(jié)構(gòu)也更清晰。鏡檢顯示，棉葉組織培養(yǎng)基中微菌核的數(shù)量明顯少于其他3種培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)6～7d后的孢子量也顯著低于其他培養(yǎng)基，但平皿上的菌落生長(zhǎng)直徑并未受到明顯抑制，表明該培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)沒(méi)有太大影響。但對(duì)微菌核的數(shù)量可能有抑制作用，卻未顯著影響其微菌核的直徑。黃薇等發(fā)現(xiàn)不同碳氮比營(yíng)養(yǎng)條件明顯影響大麗輪枝菌落葉型菌株微菌核的形成，在低碳氮比（25：1～30：1）中形成的微菌核明顯多于在高碳氮比（45：1～50：1）中形成的微菌核。PCA相對(duì)PDA來(lái)說(shuō)，淀粉含量低，碳氮比更低，因此PCA培養(yǎng)基中微菌核數(shù)量明顯多于PDA培養(yǎng)基。PCA平皿中微菌核的數(shù)量雖多，但微菌核長(zhǎng)度較短，黑色厚壁細(xì)胞多聚成團(tuán)，而非常見的長(zhǎng)條狀，因此PCA培養(yǎng)基多用于真菌菌株的保存。

3.4 棉葉組織培養(yǎng)基對(duì)病原菌的生長(zhǎng)可能有抑制作用

查式液體培養(yǎng)基多用于真菌的擴(kuò)大培養(yǎng)，黃薇等[13]發(fā)現(xiàn)40：1的碳氮比更有利于大麗輪枝菌的孢子萌發(fā)，查氏液體培養(yǎng)基中約為40：1，本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)所用的4種培養(yǎng)基中最適宜的是查式液體培養(yǎng)基。在抗病品種中，碳氮比為35：1時(shí)才利于大麗輪枝菌致病，過(guò)高或過(guò)低都不利于其致病。本調(diào)查結(jié)果與上述研究一致。

陸家云等[19]通過(guò)對(duì)大麗輪枝菌單孢菌株的單孢后代進(jìn)行多次致病力接種試驗(yàn)，認(rèn)為表現(xiàn)為野生型的菌株致病力保持不變，而表現(xiàn)為絨毛型變異體的致病力有分化，有減弱的趨勢(shì)。石磊巖等[20]在試驗(yàn)中推測(cè)T9菌系可能因室內(nèi)多次繼代使其致病性衰退。因此，在試驗(yàn)中通常以接種棉苗來(lái)復(fù)壯菌株，使其致病力得到恢復(fù)。經(jīng)棉葉組織培養(yǎng)基搖菌后發(fā)現(xiàn)，棉葉組織培養(yǎng)基對(duì)微菌核的直徑雖然沒(méi)有顯著影響，但抑制了病原菌微菌核的數(shù)量和菌絲的生長(zhǎng)，減緩其生長(zhǎng)速率，可能對(duì)病原囷在棉苗中的擴(kuò)張產(chǎn)生了不利影響。即使在接種濃度相當(dāng)?shù)臈l件下，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，病原菌V991b和V991w在棉葉組織培養(yǎng)基中病原菌的數(shù)量也可能比其他處理低。在復(fù)壯的過(guò)程中可能是植物中的其他物質(zhì)在起作用，這些物質(zhì)經(jīng)過(guò)高溫滅菌后已喪失掉其活性，無(wú)法對(duì)病原菌的擴(kuò)繁起促進(jìn)作用，導(dǎo)致棉苗發(fā)病程度和病指的下降。

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收稿日期：2020-05-18

基金項(xiàng)目：湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目（2016-620-000-001-016）;國(guó)家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)（2016ZX08012004-006）

作者簡(jiǎn)介：黃薇（1981-），女，湖北武漢人，助理研究員，碩士，主要從事棉花病害防治研究，（電話）13487097672（電子信箱）34966440@qq.com;通信作者，萬(wàn)鵬（1972-），男，湖北監(jiān)利人，研究員，博士，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲與轉(zhuǎn)基因環(huán)評(píng)研究，（電子信箱）wanpenghb@126.com。