花生種子霉變機(jī)理的初步研究

楊書香　劉錦軒　江陽

摘要：根據(jù)武漢市四季溫度和濕度特征設(shè)置4個(gè)不同溫度（8、18、28、35 ℃）和空氣相對(duì)濕度（55%、75%、85%、90%），研究花生的霉變情況，計(jì)算霉變率。采用稀釋涂布平板法，對(duì)發(fā)霉的花生進(jìn)行微生物分離接種，純化培養(yǎng)后得到2株菌株。結(jié)果表明，容易使花生種子霉變的條件為溫度28℃濕度90%，此條件下的霉變率達(dá)80.0%。通過形態(tài)觀測和顯微鏡檢測初步鑒定主要為黃曲霉菌（Aspergillus flavus）和黑曲霉菌（Aspergillus niger） 〇

關(guān)鍵詞：花生;種子霉變;黃曲霉菌（Aspergillus flavus）;黑曲霉菌（Aspergillus niger）

中圖分類號(hào)：S565.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114 （2020） 16-0072-04

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.014

霉變是微生物分解和吸收食物或植物上的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)后產(chǎn)生自身代謝產(chǎn)物的一種連續(xù)的生物化學(xué)過程，霉變發(fā)生過程中具有一定的階段性。在這個(gè)過程中，微生物吸收分解有機(jī)物或?qū)е率澄锉旧砦镔|(zhì)含量發(fā)生變化，尤其是一些敏感物質(zhì)，如一些活性酶的變化就非常明顯，因此可以通過檢測食物的相關(guān)酶活性來判斷食品霉變程度，評(píng)估食品質(zhì)量，制定解決方案，防止微生物的進(jìn)一步污染，保證食品儲(chǔ)存的安全性和壽命[1]。

在人類生活的環(huán)境中存在許多霉菌，置于儲(chǔ)存室的農(nóng)副產(chǎn)品也極易被霉菌感染，感染后的農(nóng)副產(chǎn)品安全性及食用性基本喪失，給生產(chǎn)農(nóng)戶帶來經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)如若誤用或誤食也會(huì)造成食物中毒等嚴(yán)峻的食品安全事件。當(dāng)處于適當(dāng)條件時(shí)，霉菌會(huì)不斷消耗花生或其制品中的蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，代謝后會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的毒素，且這些毒素都極不易被清除，人體或動(dòng)物食用后會(huì)出現(xiàn)食物中毒甚至死亡，對(duì)健康造成很大的負(fù)面影響?；ㄉa(chǎn)自于土壤中，在收獲時(shí)，土壤中的霉菌和真菌都隨著花生出土，如黃曲霉等。在儲(chǔ)藏期間，如若儲(chǔ)存環(huán)境的溫濕度把控不嚴(yán)，花生就極易發(fā)生霉變[2]。

由于花生富含蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，易被霉菌感染，最主要的霉菌是黃曲霉菌，其代謝時(shí)很容易產(chǎn)生黃曲霉毒素。曲霉菌屬真菌中的寄生曲霉菌和黃曲霉菌感染食物和植物后，消耗營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生代謝物質(zhì)，黃曲霉毒素就是其中的一種次生代謝產(chǎn)物，其生長性能強(qiáng)，沙土、土壤、種子、果實(shí)都可以作為其生長基質(zhì)，尤其是在玉米種子和花生等油料作物種子中較為常見，人和動(dòng)物食用后會(huì)引起癌癥、畸形、突變等狀況。黃曲霉毒素有B1、B2、G1等十余種類型，毒性最強(qiáng)的屬黃曲霉素B1，如果食品與動(dòng)物飼料中的黃曲霉素含量超過國家標(biāo)準(zhǔn)，被人體或者動(dòng)物食用后會(huì)引起食物中毒，對(duì)人類以及動(dòng)物都是一種嚴(yán)重的安全隱患[3]。

花生的儲(chǔ)存最重要的是要注意干燥、通風(fēng)。張永輝[4]在研究中提出了花生種子儲(chǔ)存要點(diǎn)包括入庫儲(chǔ)存前充分晾曬（含水量降到8%左右）、室內(nèi)通風(fēng)、干燥防潮、消毒并保證種子干凈度、不能使用塑料密封袋儲(chǔ)存等。

花生耐旱喜溫，對(duì)氣候變化反應(yīng)十分敏感，溫濕度、降雨量、溫度差以及日照強(qiáng)度的改變都會(huì)影響花生品質(zhì)[5]。武漢市常年降雨量較大，且具有溫帶四季分明的典型特征，屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候。年均氣溫為16℃，一年中1月平均氣溫最低，為0.4℃，7月和8月平均氣溫最高，達(dá)28.7℃，夏季正午溫度可達(dá)38℃。城區(qū)年平均相對(duì)濕度為75%～?85%，最高濕度可達(dá)95%，最低空氣相對(duì)濕度在55%左右[6]。為了探討花生的霉變機(jī)理，依據(jù)武漢市氣溫和空氣濕度特性，研究了不同溫度和空氣相對(duì)濕度條件下的花生霉變情況，以期為花生種子的生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過程提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品 淘寶網(wǎng)上購買白沙果品系花生，選取飽滿、無破損、無發(fā)霉、無發(fā)芽狀況的良好種子去殼后作為試驗(yàn)樣品。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 電子萬用爐（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）JY2002電子天平（上海衡平儀器儀表廠），HPX-160B5H-III恒溫恒濕培養(yǎng)箱、MJ-300BS-II 霉菌培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），YXQ-SG46-280S手提式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），250B-J生化培養(yǎng)箱（金壇市鴻科儀器廠），YS100 Nikon光學(xué)顯微鏡。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 牛肉膏、蛋白胨（北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠），氯化鈉、95%乙醇、蔗糖（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），瓊脂（武漢市華順生物技術(shù)有限公司），可溶性淀粉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），硝酸鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硝酸鈉、氯化鉀（天津市化學(xué)試劑三廠），磷酸氫二鉀（上海山浦化工有限公司），草酸鈉結(jié)晶紫、碘液、番紅染液、乳酸石碳酸棉藍(lán)染液等均為市售。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.6g，蛋白胨2g，氯化鈉1g，瓊脂0.1g，加無菌水定容至200 mL，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2， 121℃高壓滅菌20 min 。

高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉4g，硝酸鉀0.2g，氯化鈉0.1g，磷酸氫二鉀0.1g，硫酸鎂0.1g，硫酸亞鐵0.002g，瓊脂4g，加無菌水定容至200mL，調(diào)節(jié)pH 7.2～7.4，121℃高壓滅菌 20 min。

查氏培養(yǎng)基：硝酸鈉0.4g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鉀0.1g，硫酸鎂0.1g，硫酸亞鐵0.002g，蔗糖6g，瓊脂3g，加無菌水定容至200mL，121℃高壓滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯40g，蔗糖4g，瓊脂3g，加無菌水定容至200mL，121℃高壓滅菌30min。馬鈴薯去皮切成塊，煮沸30 min，用紗布過濾，加糖及瓊脂，融化后補(bǔ)足無菌水至200 mL。

1.2.2 花生種子存放條件 根據(jù)可控條件設(shè)置溫度和濕度2個(gè)因素，其中，溫度為8、18、28、35℃共4個(gè)水平，濕度為55%、70%、85%、95%共4個(gè)水平，共16個(gè)處理，每處理重復(fù)3次，1個(gè)培養(yǎng)皿視為1次重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿放入40粒去殼的花生種子，把處理好的培養(yǎng)皿置于設(shè)定好的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中[7]，進(jìn)行3d連續(xù)霉變培養(yǎng)，觀察霉變情況，并拍照記錄。

1.2.3 霉變花生中菌種的分離培養(yǎng) 取一個(gè)250 mL的錐形瓶，加入90 mL無菌水，放入已經(jīng)發(fā)生霉變的花生，置于搖床搖動(dòng)30 min，使其更好地混勻，制成菌懸液備用。采用涂布平板法對(duì)樣品菌懸液中的微生物進(jìn)行分離，將制備好的霉變花生原液設(shè)置為不同的濃度梯度，分別稀釋10、100、1000倍，用已滅菌的移液槍吸取1mL各濃度梯度的稀釋液加入到裝有4種培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，使用涂布棒將菌懸液推展開，使菌懸液均勻分布，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3次重復(fù)。將培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，PDA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和高氏1號(hào)培養(yǎng)基的溫度均恒定在28℃，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基溫度恒定在37℃。每隔24 h進(jìn)行觀察。

1.2.4 菌種的純化培養(yǎng) 待菌落在平板培養(yǎng)皿上生長進(jìn)入旺盛期時(shí)，挑取少量孢子進(jìn)行平板劃線，28℃培養(yǎng)后得到純化的霉菌菌落。

1.2.5 菌種的初步鑒定

1）培養(yǎng)特征的觀察。通過觀察霉菌菌落生長繁殖速率、菌落顏色、形態(tài)，菌絲的緊密度、性質(zhì)，孢子的顏色、形態(tài)，培養(yǎng)基顏色變化、氣味等判別菌種[8]。

2）鏡檢。從乙醇中取出載玻片，置于火焰上灼燒后，待其冷卻，在載玻片正中央滴1滴乳酸石碳酸棉藍(lán)染液，用鑷子從霉菌菌落邊緣取少量帶有孢子的霉菌菌絲，先放入50%乙醇中浸一下洗去脫落的孢子，置于乳酸石碳酸棉藍(lán)染液中，用解剖針去除粘在菌絲根部的培養(yǎng)基，并將菌絲分開蓋上蓋玻片，在低倍鏡中找到物像后切換至高倍鏡下觀察。

2結(jié)果與分析

2.1 不同條件下花生霉變情況

在溫度8℃、濕度55%的處理?xiàng)l件下，培養(yǎng)3 d后霉變粒數(shù)為0粒（圖1a）;在溫度18℃、濕度70%的處理?xiàng)l件下，培養(yǎng)3d后霉變粒數(shù)為3粒，且霉變現(xiàn)象不明顯（圖1b）;在溫度35℃、濕度70%的處理?xiàng)l件下，培養(yǎng)3d后霉變粒數(shù)為21粒，且霉變現(xiàn)象較明顯（圖1c）;在溫度28 ℃、濕度70%的處理?xiàng)l件下，培養(yǎng)3d后霉變粒數(shù)為72粒（圖1d）;在溫度28℃、濕度95%的處理?xiàng)l件下，培養(yǎng)3d后霉變粒數(shù)為96粒，且霉變現(xiàn)象非常明顯（圖1e）。

根據(jù)公式：霉變率=霉變果粒數(shù)/檢測的總粒數(shù)×100%[8]計(jì)算霉變率。由表1可知，當(dāng)溫度低于18℃，空氣濕度在70%以下時(shí)，花生未出現(xiàn)霉變狀況;當(dāng)溫度高于18℃，空氣濕度在70%及以上時(shí)，花生有霉變現(xiàn)象;當(dāng)溫度為28℃，濕度95%時(shí)，霉變率最局，為 80.0%。

在相同溫度條件下，濕度不同時(shí)霉變率變化情況見圖2。由圖2可以看出，溫度不變時(shí)，在設(shè)置的濕度范圍內(nèi)，除8℃溫度條件下都為0以外，濕度越高，霉變率越高。

由圖3可以看出，空氣濕度不變時(shí)，除55%濕度條件下都為0以外，霉變率在8～28℃都呈不斷上升狀態(tài)，在28～35℃，霉變率開始下降，在28℃時(shí)霉變率達(dá)到峰值。

2.2 四種培養(yǎng)基上菌落的分布

由表2可以看出，查氏培養(yǎng)基9個(gè)培養(yǎng)基全部有菌落生長，PDA培養(yǎng)基有5個(gè)培養(yǎng)基有菌落生長，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和高氏1號(hào)培養(yǎng)基沒有菌落生長，判斷霉變花生原液中的微生物類型可能為霉菌。

2.3分離菌株的形態(tài)特征

將查氏培養(yǎng)基上生長狀況旺盛的菌落采用劃線平板分離法進(jìn)行接種，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行純化培養(yǎng)，每隔24h觀察1次，待菌落長勢良好后進(jìn)行顯微鏡檢測。結(jié)果得到1株A菌株，菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)如圖4所示。由圖4可以看出，A菌落在培養(yǎng)基上生長繁殖速度快，顏色為黃色且?guī)в械G色，表面呈稠密的粉末顆粒狀。分生孢子為黃色，頂囊形態(tài)巨大呈橢圓形，從形態(tài)上初步判斷是黃曲霉菌（Aspergilla flavus）。培養(yǎng)基帶有霉味和腐臭味。

將PDA培養(yǎng)基上生長的菌落接種、純化培養(yǎng)，每隔24h觀察1次，待菌落長勢良好時(shí)進(jìn)行顯微鏡檢測，結(jié)果得到1株B菌株，菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)如圖5所示。由圖5可以看出，B菌落在培養(yǎng)基上生長繁殖速度較快，培養(yǎng)前期為白色絮狀，蔓延性強(qiáng)，培養(yǎng)后期長出黑色孢子，呈粉末絮狀。分生孢子為黑色，頂囊形態(tài)巨大呈球形，從形態(tài)上初步判斷為黑曲霉菌（Aspergills niger）。培養(yǎng)基帶有霉味和腐臭味。

3小結(jié)

本研究分析了花生在日常儲(chǔ)存條件（不同的溫度和空氣相對(duì)濕度）下的霉變情況，并對(duì)霉變后的花生進(jìn)行傳統(tǒng)的微生物檢測。結(jié)果顯示，當(dāng)溫度高于18℃，空氣相對(duì)濕度高于70%時(shí)出現(xiàn)霉變現(xiàn)象，且在溫度28℃和濕度95%時(shí)霉變程度最明顯，霉變率達(dá)80.0%。根據(jù)霉變率可以判斷，濕度相同時(shí)，霉變率隨著溫度的上升呈先上升后下降的趨勢，在28℃時(shí)，霉變率達(dá)到了峰值;溫度相同時(shí)，霉變率隨著濕度的上升逐漸增加。微生物檢測采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法，分離菌種后進(jìn)行純化，初步判斷為黃曲霉菌和黑曲霉菌。黃曲霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物黃曲霉素是一種具毒性的致癌物質(zhì)，能引發(fā)人體與動(dòng)物中毒，對(duì)人體的健康和兒童的發(fā)育帶來嚴(yán)重影響[9]。由此可見，花生的正確儲(chǔ)存至關(guān)重要，在日常儲(chǔ)存花生時(shí)應(yīng)避免放在溫度高、潮濕的地方，尤其在春夏梅雨季節(jié)時(shí)要注意對(duì)儲(chǔ)存花生的裝置進(jìn)行除濕、控溫處理，否則花生會(huì)發(fā)生霉變，食用后易對(duì)人體造成危害。

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收稿日期：2019-09-02

作者簡介：楊書香（1978-），女，湖北荊州人，副教授，碩士，主要從事植物學(xué)研究，（電話）13237176800（電子信箱）54242788@qq.com;通信作者，江陽（1983-），男，講師，碩士，主要從事化學(xué)方面的教學(xué)工作。