當(dāng)歸芍藥散對(duì)腎病綜合征幼鼠足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的保護(hù)作用

張?zhí)煺?/p>

【摘要】 目的：探討當(dāng)歸芍藥散對(duì)腎病綜合征幼鼠足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的保護(hù)作用。方法：選取4周齡幼鼠40只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、坎地沙坦組及中藥組，每組10只。模型組、坎地沙坦組及中藥組通過阿霉素尾靜脈注射建立腎病綜合征模型，造模成功后中藥組予以當(dāng)歸芍藥散水煎濃縮劑灌胃，坎地沙坦組予以坎地沙坦酯片混懸液灌胃，空白組與模型組予以0.9%氯化鈉溶液灌胃。灌胃4周后比較四組一般狀態(tài)、體重、24 h尿蛋白、血清白蛋白水平，電鏡觀測(cè)腎小球足細(xì)胞損傷情況，比較四組RANK、RANKL、α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：干預(yù)后，模型組一般狀態(tài)差、眼瞼可見水腫。中藥組與坎地沙坦組一般狀態(tài)均略優(yōu)于模型組。干預(yù)后，模型組、中藥組及坎地沙坦組體重與血清白蛋白水平低于空白組，而24 h尿蛋白高于空白組（P<0.05）。中藥組與坎地沙坦組體重與血清白蛋白均高于模型組，而24 h尿蛋白均低于模型組（P<0.05）。干預(yù)后，模型組、中藥組及坎地沙坦組RANK、RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于空白組，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于空白組（P<0.05）。中藥組及坎地沙坦組RANK、RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于模型組（P<0.05）。模型組電鏡下可見足突融合，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。中藥組及坎地沙坦組足突融合程度較輕，可見少量完好足細(xì)胞。結(jié)論：當(dāng)歸芍藥散對(duì)腎病綜合征幼鼠具有一定的治療作用，這種作用可能是通過改善其腎臟RANK、RANKL、α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸芍藥散 腎病綜合征 足細(xì)胞 肌動(dòng)蛋白骨架

Protective Effect of Danggui Shaoyao Powder on Podocyte Actin Skeleton in Young Rats with Nephrotic Syndrome/ZHANG Tianzhao. //Medical Innovation of China， 2020， 17（22）： 00-005

[Abstract] Objective： To investigate the protective effect of Danggui Shaoyao Powder on podocyte actin skeleton in young rats with nephrotic syndrome. Method： A total of 40 rats aged 4 weeks were selected. They were divided into blank group， model group， Candesartan group and Chinese medicine group according to the random number table method， with 10 rats in each group. Nephrotic syndrome model was established by intravenous injection of Adriamycin in the model group， Candesartan group and Chinese medicine group. After the success of the building， the Chinese medicine group was gavaged with Danggui Shaoyao powder decoction concentrate， the Candesartan group was gavaged with suspension of Candesartan tablets， the blank group and model group were gavaged with 0.9% sodium chloride solution. After 4 weeks of gavage， the general status， body weight， 24 h urinary protein and serum albumin level of the four groups were compared. The damage of glomerular podocyte were observed by electron microscopy， the expressions of RANK， RANKL， α-actinin-4 and Synaptopodin mRNA of the four groups were compared. Result： After intervention， the general state of the model group was poor with eyelid edema. The general state of the Chinese medicine group and Candesartan group were slightly better than that of the model group. After intervention， the body weight and serum albumin levels of the model group， Chinese medicine group and Candesartan group were lower than those of the blank group， while the 24 h urine protein were higher than that of the blank group （P<0.05）. The weight and serum albumin of the Chinese medicine group and the Candesartan group were higher than those of the model group， while the 24 h urine protein were lower than those of the model group （P<0.05）. After intervention， the mRNA relative expression levels of RANK and RANKL in the model group， Chinese medicine group and Candisartan group were higher than those in the blank group， while the mRNA relative expression levels of α-actinin-4 and Synaptopodin were lower than those in the blank group （P<0.05）. The mRNA relative expression levels of RANK and RANKL in the Chinese medicine group and Candesartan group were lower than those in the model group， while the mRNA relative expression levels of α-actinin-4 and Synaptopodin were higher than those in the model group （P<0.05）. The fusion of podocyte and the destruction of podocyte structure were observed under electron microscope in the model group. The fusion degree of podocyte in the Chinese medicine group and Candesartan group were relatively light， and a few intact podocyte cells could be seen. Conclusion： Danggui Shaoyao powder has a certain therapeutic effect on young rats with nephrotic syndrome. This effect may be achieved by improving the expression of RANK， RANKL， α-actinin-4， and Synaptopodin mRNA in the kidney.

[Key words] Danggui Shaoyao Powder Nephrotic syndrome Podocyte Actin skeleton

First-authors address： Heilongjiang Traditional Chinese Medicine Hospital， Harbin 150036， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.22.001

小兒腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）多由感染、免疫力低下引起，其發(fā)病有逐年上升趨勢(shì)[1]。小兒NS主要癥狀為大量蛋白尿、水腫、低蛋白血癥等，其腎臟病理多為微小病變型改變，以腎小球足細(xì)胞損傷為主，足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)主要由肌動(dòng)蛋白骨架支撐，該結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致足細(xì)胞濾過屏障功能減弱，從而出現(xiàn)蛋白尿等一系列癥狀[2]。西醫(yī)治療NS主要以降低腎小球內(nèi)壓、皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等方案為主，雖有療效但副作用較大。當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，具有養(yǎng)血調(diào)肝，健脾利濕之功效，原文中提到其主治婦人妊娠或經(jīng)期腹痛頭暈或下肢浮腫，現(xiàn)代醫(yī)家依據(jù)異病同治理論，以之治療多種疾病[3]。筆者以當(dāng)歸芍藥散治療小兒腎病綜合征，效果較好，現(xiàn)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入研究其作用機(jī)理，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本次實(shí)驗(yàn)自2019年5-7月，

選取購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的4周齡雄性SD大鼠，平均體重（208.42±8.36）g。

所有幼鼠常規(guī)飼養(yǎng)，定時(shí)通風(fēng)，普通飼料，正常飲水，溫度控制在（23.0±2.0）℃，濕度50%左右，氨濃度不高于20 ppm。墊料每

3天更換1次，飼養(yǎng)籠每3天清洗1次。（2）實(shí)驗(yàn)藥物：治療性藥物均由本院藥局提供，當(dāng)歸芍藥散組成為當(dāng)歸9 g，芍藥18 g，川芎24 g，茯苓12 g，澤瀉24 g，炒白術(shù)12 g，藥材切碎后以水浸泡40～60 min，煎煮3次取汁混合，恒溫水浴濃縮得到總生藥濃度為1.5 g/mL藥液備用，坎地沙坦酯片購(gòu)于重慶圣華曦藥業(yè)，以蒸餾水制備為20 mg/mL混懸液備用。（3）實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：阿霉素購(gòu)自合肥巴斯夫，配制為1 mg/mL溶液2 ℃保存，水合氯醛來自青島宇龍海藻，配置為10%溶液2 ℃保存;兔抗鼠RANK、RANKL購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗鼠β-actin、山羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;α-actinin-4抗體、Synaptopodin抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;其余基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)材料及器材均由實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型制備 幼鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、坎地沙坦組、中藥組各10只。模型組、坎地沙坦組、中藥組于實(shí)驗(yàn)第4天進(jìn)行阿霉素造模，以6.5 mg/kg尾靜脈注射，分為4.0 mg/kg、2.5 mg/kg兩次給藥，時(shí)間間隔1周[4]。造模操作如下：幼鼠提前12 h禁食不禁水，首先測(cè)量體重，根據(jù)體重計(jì)算阿霉素劑量，抽取藥物至1 mL注射器中置于2 ℃環(huán)境備用，然后將幼鼠以固定器固定并暴露尾部，40 ℃溫水浸泡鼠尾使鼠尾靜脈充盈，用碘伏消毒鼠尾皮膚，先取內(nèi)存0.9%氯化鈉溶液的注射器自腹側(cè)尾靜脈遠(yuǎn)端的1/3處，15°角斜行進(jìn)針，刺入血管后平行進(jìn)針，回抽見血，證實(shí)針頭在血管內(nèi)，迅速換上含阿霉素注射液注射器緩慢推注。因阿霉素滲漏可導(dǎo)致幼鼠尾部組織腐爛，故推注過程中密切觀察進(jìn)針處，如有藥液滲漏則立即停止給藥，盡量將滲出藥液擠出，然后更換位置重新進(jìn)針給藥，靜注藥物完畢后更換注射器推注0.1～0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液以沖凈針頭內(nèi)藥物，尾靜脈注射液體總量不超過10 mL/kg體重。

1.2.2 給藥方法 2次阿霉素給藥完成后間隔1周開始給予治療性藥物，坎地沙坦組予以坎地沙坦酯片混懸液灌胃，中藥組予以當(dāng)歸芍藥散灌胃，給藥劑量參考公式幼鼠劑量（g/kg）=兒童劑量（g/kg）×折算系數(shù)（6）[5]。將各鼠藥物計(jì)算完成后，可將中藥及西藥溶液再次恒溫濃縮至不超過2 mL，分為2次灌胃，空白組與模型組分別予以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃持續(xù)4周。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn) 灌胃4周后，將幼鼠禁食不禁水12 h，代謝籠留取幼鼠24 h尿，考馬斯亮藍(lán)法監(jiān)測(cè)24 h尿蛋白定量。水合氯醛麻醉幼鼠，腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)血清白蛋白水平。取血后取出幼鼠腎臟，組織學(xué)固定后，脫水包埋，電鏡下觀察足細(xì)胞損傷情況，以RT-PCR法檢測(cè)腎臟RANK、RANKL、α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組一般狀態(tài)情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組幼鼠無死亡，空白組幼鼠一般狀態(tài)正常，體重隨發(fā)育而增長(zhǎng)，其他均正常。模型組幼鼠精神萎靡，動(dòng)作活潑性下降、食水量減少，皮毛光澤暗、眼瞼及四肢末端可見水腫，耳部、尾部等處呈現(xiàn)不同程度的蒼白。中藥組與坎地沙坦組上述狀態(tài)均略優(yōu)于模型組。

2.2 四組體重及生化指標(biāo)比較 干預(yù)后，模型組、中藥組及坎地沙坦組體重與血清白蛋白水平低于空白組，而24 h尿蛋白高于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中藥組與坎地沙坦組體重與血清白蛋白均高于模型組，而24 h尿蛋白均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中藥組與坎地沙坦組體重、24 h尿蛋白及血清白蛋白比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3 四組足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架相關(guān)指標(biāo)mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 干預(yù)后，模型組、中藥組及坎地沙坦組RANK、RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于空白組，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中藥組及坎地沙坦組RANK、RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。中藥組及坎地沙坦組上述各指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4 四組電鏡下腎小球足細(xì)胞情況 空白組電鏡下可見正常足細(xì)胞排列，足突結(jié)構(gòu)完整。模型組可見足突融合，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞。中藥組及坎地沙坦組足突融合程度較輕，可見少量完好足細(xì)胞。見圖1。

3 討論

作為腎小球固有細(xì)胞，足細(xì)胞附著于腎小球基底膜外側(cè)，與毛細(xì)血管內(nèi)皮共同構(gòu)成腎小球血液濾過屏障，該屏障結(jié)構(gòu)復(fù)雜，任何一處發(fā)生異常都可導(dǎo)致整體結(jié)構(gòu)破壞而出現(xiàn)功能障礙[6]。因此，蛋白尿產(chǎn)生的根本即為足細(xì)胞損傷[7]。免疫因子破壞，抗原抗體復(fù)合物沉積、血流動(dòng)力學(xué)改變都可以損傷足細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成足突融合、足細(xì)胞凋亡等，從而產(chǎn)生尿蛋白，除此之外，足細(xì)胞特異蛋白分子下調(diào)和足細(xì)胞細(xì)胞骨架成分的變化，也可以引起上述病理改變，影響腎小球?yàn)V過屏障，產(chǎn)生蛋白尿[8]。α-actinin-4是足細(xì)胞的一種細(xì)胞骨架蛋白，該蛋白特異性的表達(dá)于腎小球足細(xì)胞，能夠交聯(lián)肌動(dòng)蛋白微絲，在它的作用下，松散的肌動(dòng)蛋白可被交聯(lián)成具有收縮能力的纖維束，從而保持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)[9]。Synaptopodin通過膜相關(guān)鳥苷酸反轉(zhuǎn)激酶1抗原與肌動(dòng)蛋白微絲緊密相連，可維持足細(xì)胞足突部分的正常形態(tài)，是足細(xì)胞重要的骨架調(diào)節(jié)蛋白，其他腎臟疾病的研究及本文所屬課題研究中發(fā)現(xiàn)，RANKL與RANK在這些疾病中高表達(dá)，并且與Synaptopodin高度重合，提示RANK特異性表達(dá)于足細(xì)胞，參與足細(xì)胞損傷[10]。

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)后模型組幼鼠一般狀態(tài)差、眼瞼可見水腫，電鏡下可見足突融合破壞，模型組體重與血清白蛋白低于空白組，而24 h尿蛋白高于空白組（P<0.05）;中藥組與坎地沙坦組體重與血清白蛋白均高于模型組，而24 h尿蛋白均低于模型組（P<0.05）。干預(yù)后，模型組、中藥組及坎地沙坦組RANK、RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于空白組，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于空白組（P<0.05）。中藥組及坎地沙坦組RANK、RANKL mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于模型組（P<0.05）。提示坎地沙坦與當(dāng)歸芍藥散能下調(diào)RANK、RANKL mRNA表達(dá)水平，延緩足細(xì)胞破壞，并能上調(diào)腎臟α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表達(dá)水平，使腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)固，從而對(duì)腎病綜合征產(chǎn)生治療作用。坎地沙坦在腎臟疾病的治療中應(yīng)用較為廣泛，能夠通過調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)降低腎小球內(nèi)壓，從而降低尿蛋白，并對(duì)腎小球具有一定程度的保護(hù)作用，其療效確切，副作用較小，在臨床上應(yīng)用較為廣泛[11]。當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，方中當(dāng)歸味甘辛性溫，歸心肝脾經(jīng)，可滋養(yǎng)肝血并能消腫止痛[12-13];白芍味苦酸甘，歸肝脾經(jīng)，可養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛[14];歸、芍配伍共為君藥，具養(yǎng)血柔肝之功[15];佐以川芎辛溫，行血中之滯氣，為血中之氣藥[16];茯苓味甘性平，可滲濕以利小便[17];白術(shù)味甘苦性溫，可健脾燥濕祛體內(nèi)之濕邪[18];全方合用，具有養(yǎng)血調(diào)肝，健脾利濕之功效，可治療腎病綜合征水腫脾虛水泛證型，其臨床療效較好[19-20]。

綜上所述，當(dāng)歸芍藥散對(duì)阿霉素腎病綜合征幼鼠具有一定的治療作用，這種作用可能是通過改善其腎臟RANK、RANKL、α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

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（收稿日期：2019-12-10） （本文編輯：田婧）