全氟辛酸PFOA對(duì)斑馬魚(yú)生物毒性效應(yīng)的影響研究

潘偉一,韓菊,沈洪艷

(1.河北科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省藥用分子化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050018)

全氟辛酸(C8F17COOH，簡(jiǎn)稱PFOA)是一種新型持久性有機(jī)污染物[1]。因其具有較強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性、抗氧化性及疏水、疏脂等特性[2-3]，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)生活用品中[4-6]，易蓄積在環(huán)境水體中，在長(zhǎng)江和黃河等水體中均有檢出[7-8]，因其具有難降解性、持久性、蓄積性及生物毒性[9-10]，已經(jīng)在生態(tài)系統(tǒng)中廣泛傳播，并通過(guò)食物鏈蓄積在食肉動(dòng)物和人體內(nèi)[11]。因此，PFOA毒性效應(yīng)已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，本研究以斑馬魚(yú)為受試生物，研究水體中PFOA對(duì)斑馬魚(yú)自由基(ROS)、超氧化歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶(AchE)和乳酸脫氫酶(LDH)的影響，為PFOA對(duì)水生生物毒性提供毒理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

斑馬魚(yú)，購(gòu)自某生物研究所；ROS，購(gòu)自德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；SOD、MDA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；PFOA(純度為96%)、二甲基亞砜試劑(無(wú)水溶劑級(jí))均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇為優(yōu)級(jí)純；乙醇、冰醋酸均為分析純。

JJ323BC精密電子天平；2-16PK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；Spectramax190酶標(biāo)儀；photochem抗氧化劑自由基分析儀；Pipet-Lite和TopPette Pipettor移液槍；HH-4恒溫水浴鍋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)生物培養(yǎng) 斑馬魚(yú)在充分曝氣的自來(lái)水中馴養(yǎng)15 d，以充分適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，馴養(yǎng)期間斑馬魚(yú)自然死亡率低于2%，并在實(shí)驗(yàn)前24 h停止喂養(yǎng)。

1.2.2 毒性實(shí)驗(yàn) 本研究為亞急性毒性實(shí)驗(yàn)，為保證受試生物在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不死亡，設(shè)置實(shí)驗(yàn)最高暴露組濃度為96 h半數(shù)致死濃度的1/5，根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PFOA 96 h LC50為661.695 mg/L，所以設(shè)置本實(shí)驗(yàn)暴露組濃度分別為0,5,15,45,135 mg/L。每個(gè)暴露組設(shè)3組平行，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用靜態(tài)實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)期間，在玻璃魚(yú)缸中分別加入4 L對(duì)應(yīng)濃度的PFOA實(shí)驗(yàn)液體，將馴養(yǎng)后的斑馬魚(yú)投放至各暴露組，每組25條，于暴露后的第3,6,9,12,15 d測(cè)定斑馬魚(yú)肌肉組織中組織蛋白含量、ROS含量、SOD活力、MDA含量、LDH活性，斑馬魚(yú)頭部AchE活性。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)作圖使用Origin 8.6，使用GraphPad Prism 5、SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn)，p<0.05表示輕微顯著性差異，標(biāo)記為*，p<0.01表示顯著性差異，標(biāo)記為**，p<0.001表示極顯著性差異，標(biāo)記為***。

2 結(jié)果與討論

2.1 PFOA對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織ROS含量的影響

圖1 各暴露組PFOA對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織ROS含量的影響Fig.1 Effects of PFOA in each exposed group on ROS content in zebrafish muscle tissue

由圖1可知，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)溶劑對(duì)照組與空白組斑馬魚(yú)肌肉組織ROS含量無(wú)顯著差異，且趨于一致，由此判定助溶劑對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織毒性可忽略不計(jì)，不影響PFOS對(duì)ROS含量的毒性效應(yīng)。暴露第3 d，各暴露組ROS含量均高于空白組，表明斑馬魚(yú)對(duì)PFOA有應(yīng)激反應(yīng)，除15 mg/L暴露組以外，其余5,45,135 mg/L暴露組ROS含量均顯著高于空白組(P<0.05)，且暴露濃度越高，產(chǎn)生的ROS值越高，其中135 mg/L暴露組ROS含量最高，為0.060 μmol/mL，這表明PFOA打破了斑馬魚(yú)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，迫使其產(chǎn)生ROS應(yīng)對(duì)污染環(huán)境。暴露至第6 d時(shí)，各暴露組與空白組相比顯著性差異更明顯(P<0.01)，其中在5 mg/L暴露組中ROS含量比空白組高出0.013 μmol/mL，表明斑馬魚(yú)肌體持續(xù)受到PFOA脅迫后，斑馬魚(yú)機(jī)體內(nèi)多余的ROS未被清除。暴露第12 d，斑馬魚(yú)肌肉組織中ROS顯著減少(P<0.01)，表明魚(yú)體內(nèi)應(yīng)脅迫產(chǎn)生的ROS已被SOD清除，但135 mg/L暴露組ROS含量仍高于空白組，直至暴露后第15 d 135 mg/L暴露組ROS含量與空白組才無(wú)顯著差異，表明在第15 d 135 mg/L暴露組斑馬魚(yú)體內(nèi)應(yīng)PFOA脅迫產(chǎn)生的ROS才被SOD清除，但ROS消除時(shí)間較5,15,45 mg/L暴露組延遲了3 d，表明高濃度的PFOA對(duì)斑馬魚(yú)ROS誘導(dǎo)作用更顯著，呈現(xiàn)明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。Jia等[14]通過(guò)研究異煙肼對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的毒性效應(yīng)得出:異煙肼對(duì)斑馬魚(yú)ROS具有誘導(dǎo)作用，并引起斑馬魚(yú)肌體抗氧化能力下降，本研究斑馬魚(yú)肌肉組織內(nèi)ROS含量在暴露9 d內(nèi)顯著高于空白組，說(shuō)明PFOA對(duì)斑馬魚(yú)ROS同樣具有誘導(dǎo)作用。

2.2 PFOA對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織SOD活力的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是一種抗氧化酶，可以消除機(jī)體內(nèi)ROS，保護(hù)機(jī)體免受損傷，對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，是一類敏感的分子生態(tài)毒理學(xué)指標(biāo)[15-16]。各暴露組PFOA對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織SOD活力的影響見(jiàn)圖2。

圖2 各暴露組PFOA對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織SOD活力的影響Fig.2 Effects of PFOA in each exposed group on SOD activity in zebrafish muscle tissue

由圖2可知，在暴露第3 d，與空白組相比暴露于5 mg/L PFOA的斑馬魚(yú)SOD活力出現(xiàn)輕微顯著差異(P<0.05)，135 mg/L暴露組出現(xiàn)了顯著差異(P<0.01)，但PFOA對(duì)斑馬魚(yú)SOD活力均表現(xiàn)為抑制作用。暴露第6 d，15 mg/L暴露組出現(xiàn)了極顯著差異(P<0.001)，各暴露組斑馬魚(yú)機(jī)體內(nèi)SOD活力均低于空白組，且隨著暴露組濃度的升高，SOD活力顯著降低(P<0.01)，表明魚(yú)體受到PFOA脅迫后，產(chǎn)生ROS(見(jiàn)圖1)，SOD為消除ROS大量減少，表現(xiàn)為抑制作用，與ROS含量變化相比較，魚(yú)體內(nèi)SOD活力與ROS含量變化呈現(xiàn)“相反”趨勢(shì)。暴露9 d后，5,15,45 mg/L暴露組SOD活力均高于空白組，且達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)最高值，分別為54.782，44.692，51.387 U/mgprot，表明肌體為了消除PFOA對(duì)肌體造成的氧化損傷產(chǎn)生大量SOD用于消除ROS。此時(shí)，PFOA對(duì)SOD表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，但135 mg/L暴露組SOD活力低于空白組，PFOA對(duì)SOD表現(xiàn)為抑制作用。暴露第12～15 d，5,15,45 mg/L暴露組SOD活力與空白組無(wú)顯著差異，這表明魚(yú)體抗氧化系統(tǒng)與外界脅迫達(dá)到了平衡，由圖2可知，此時(shí)ROS含量也顯著降低，并恢復(fù)至空白組水平，表明魚(yú)體已經(jīng)消除了PFOA對(duì)肌體的不利影響。但135 mg/L暴露組SOD仍顯著低于空白組(P<0.01)，此時(shí)ROS含量已經(jīng)恢復(fù)至空白組水平，表明為消除ROS消耗了大量SOD，也可能是隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，PFOA濃度的升高，SOD的合成受到一定影響，所以135 mg/L的PFOA對(duì)斑馬魚(yú)SOD活性有抑制作用。高問(wèn)等[17]通過(guò)土霉素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的生物毒性效應(yīng)研究也發(fā)現(xiàn)，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)低濃度的土霉素廢水可引起斑馬魚(yú)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致SOD被誘導(dǎo)，而高濃度土霉素廢水可以抑制SOD的合成，與本文研究結(jié)果一致。

2.3 PFOA對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織MDA活力的影響

丙二醛(MDA)是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物，可以反映細(xì)胞損傷的程度，其含量越高，機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化損傷越嚴(yán)重[18-19]。MDA含量與ROS含量在一定程度上具有一定的正相關(guān)性，與SOD活力在一定程度上有一定的負(fù)相關(guān)性。各暴露組PFOA對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織MDA含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 各暴露組PFOA對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織MDA活力的影響Fig.3 Effects of PFOA in each exposed group on MDA content in zebrafish muscle tissue

由圖3可知，斑馬魚(yú)暴露于PFOA后第3～9 d，各暴露組MDA含量均顯著高于空白組，其中15,135 mg/L差異極顯著(P<0.001)，表明PFOA誘導(dǎo)魚(yú)體產(chǎn)生了ROS，未被SOD消除的ROS攻擊了生物膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，產(chǎn)生大量MDA。其中45 mg/L暴露組MDA含量在第6 d達(dá)到本次實(shí)驗(yàn)峰值5.08 nmol/mgprot。當(dāng)暴露時(shí)間延長(zhǎng)至第12 d，除15 mg/L暴露組外，其余各暴露組MDA含量均顯著低于空白組(P<0.01)，同時(shí)，各暴露組斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS含量顯著低于空白組，SOD活力與空白組均無(wú)顯著差異，表明魚(yú)體內(nèi)ROS已經(jīng)被消除，因此斑馬魚(yú)體內(nèi)不產(chǎn)生MDA。暴露第15 d，各暴露組MDA含量與空白組均無(wú)顯著差異，各暴露組MDA的含量恢復(fù)到正常水平，與ROS含量變化相一致，表明機(jī)體已經(jīng)適應(yīng)了PFOA造成的氧化損傷。王奇等[20]通過(guò)研究磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異惡唑三種典型磺胺類抗生素對(duì)羅非魚(yú)肝臟組織中丙二醛含量的影響發(fā)現(xiàn)，MDA含量在暴露前期達(dá)到最大，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減小，最終MDA含量降低到基本與空白組相當(dāng)，與本研究MDA變化趨勢(shì)一致。

2.4 PFOA對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活性的影響

乙酰膽堿酯酶(AchE)是一種與生物神經(jīng)傳導(dǎo)有關(guān)的酶，是反映水生生物受到外界脅迫危害程度的毒理學(xué)指標(biāo)之一[21]，AchE廣泛存在于各種動(dòng)物組織中，在神經(jīng)突觸間隙中，通過(guò)催化水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿來(lái)終止其對(duì)膽堿受體的興奮作用，維持神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞，其活性升高則會(huì)抑制興奮的傳遞，活性降低則表現(xiàn)為過(guò)度興奮，無(wú)論其活性升高或者降低都會(huì)影響斑馬魚(yú)正常的生理生化功能[22-23]。各暴露組PFOA對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 各暴露組PFOA對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活力的影響Fig.4 Effects of PFOA in each exposed group on AchE activity in zebrafish head

由圖4可知，隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，PFOA對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制，斑馬魚(yú)暴露于PFOA后到實(shí)驗(yàn)第9 d，各濃度組斑馬魚(yú)頭部AchE活力均隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，PFOA對(duì)AchE活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。其中，5 mg/L暴露組在第3 d和第6 d顯著高于空白組(P<0.05)；但暴露的第12 d，5，15 mg/L濃度組斑馬魚(yú)頭部AchE活性高于對(duì)照組，但45，135 mg/L濃度組AchE活性顯著低于空白組(P<0.01)，即低濃度的PFOA促進(jìn)了AchE活性，高濃度的PFOA抑制了AchE活性。暴露至第15 d，5，15，45 mg/L濃度組與空白組相比AchE活性受到顯著抑制(P<0.01)，分析原因，PFOA具有神經(jīng)毒性，對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)有破壞作用，導(dǎo)致神經(jīng)突觸間隙中乙酰膽堿數(shù)量減少，從而抑制了興奮的傳遞。但到第12 d以后，濃度大于45 mg/L的PFOA抑制AchE活力，AchE活力降低，這可能是高濃度的PFOA破壞了神經(jīng)遞質(zhì)的傳導(dǎo)，表現(xiàn)出明顯的時(shí)間-劑量關(guān)系。Guo等[24]通過(guò)研究全氟化合物對(duì)斑馬魚(yú)的神經(jīng)毒性效應(yīng)發(fā)現(xiàn)，PFDoA破壞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)(包括膽堿能和多巴胺信號(hào)系統(tǒng))、抑制神經(jīng)元發(fā)育，與本文中PFOA通過(guò)誘導(dǎo)AchE活性，間接影響神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的數(shù)量，破壞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)結(jié)論相一致。

3 結(jié)論

(1)本研究發(fā)現(xiàn)PFOA可以引起斑馬魚(yú)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并呈現(xiàn)出時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系和劑量-效應(yīng)關(guān)系。暴露期間ROS與MDA含量變化呈現(xiàn)正相關(guān)性，但ROS、MDA含量變化與SOD活力變化呈現(xiàn)“相反”趨勢(shì)。

(2)PFOA對(duì)斑馬魚(yú)體ROS具有誘導(dǎo)作用，且高濃度的PFOA對(duì)斑馬魚(yú)ROS誘導(dǎo)作用更顯著。MDA含量在暴露第6 d達(dá)到最大，并隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減小，最終MDA含量降低到基本與空白組水平相當(dāng)，該變化與ROS變化相一致，充分證明ROS與MDA含量變化呈現(xiàn)正相關(guān)性。

(3)在暴露前9 d，PFOA對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)SOD活力表現(xiàn)為先抑制后誘導(dǎo)的作用，魚(yú)體內(nèi)SOD活力與ROS與MDA含量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性。但暴露至12 d以后，低濃度暴露組斑馬魚(yú)SOD活力可恢復(fù)至空白組水平，高濃度暴露組SOD活力仍受到顯著抑制。

(4)PFOA具有神經(jīng)毒性，通過(guò)誘導(dǎo)AchE活性，使斑馬魚(yú)神經(jīng)突觸間隙中乙酰膽堿數(shù)量減少，從而抑制興奮的傳遞。在整個(gè)暴露周期內(nèi)，隨著暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，PFOA對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制。