基于香氣活性值的福建尤溪煙葉提取物香氣特征成分分析

茅中一，洪祖燦，劉加增，周培琛，伊勇濤，操曉亮，張曉兵，謝金棟*

1.福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建省廈門市集美區(qū)濱水路298號(hào) 361021 2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)系，福建省廈門市思明南路422號(hào) 361005 3.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001

福建煙區(qū)生態(tài)條件適合產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)煙葉，是典型的清香型煙葉產(chǎn)區(qū)［1］。在全國(guó)烤煙煙葉香型風(fēng)格區(qū)劃中，福建煙葉風(fēng)格特征是以干草香、清甜香、蜜甜香為主體，輔以青香、醇甜香、木香、烘焙香、焦香、花香和辛香等［2］，其香氣風(fēng)格是不同香韻特征的綜合效應(yīng)，而每種香韻特征的形成均具有復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)。為發(fā)揮福建煙葉原料特點(diǎn)，凸顯煙葉香韻風(fēng)格特征，需要闡明其內(nèi)在致香成分對(duì)香韻特征的貢獻(xiàn)。

關(guān)于福建煙葉化學(xué)成分的定性分析［3-4］和烤煙煙葉理化指標(biāo)與煙葉風(fēng)格特征的相關(guān)分析［5-6］已有較多報(bào)道，但香氣成分分析結(jié)果無法較好地與卷煙感官品質(zhì)建立關(guān)聯(lián)。在食品風(fēng)味分析領(lǐng)域大量研究報(bào)道中使用香氣或滋味活性值（Odor/Taste activity value，OAV/TAV）技術(shù)將香氣成分分析結(jié)果與感官評(píng)價(jià)建立關(guān)聯(lián)，從而篩選復(fù)雜體系關(guān)鍵香氣活性成分、表征香氣風(fēng)格特征等［7-10］。近年來國(guó)內(nèi)外也先后將OAV/TAV概念引入煙草科學(xué)研究領(lǐng)域，例如利用TAV技術(shù)分析了煙葉或煙氣中關(guān)鍵酸味和甜味物質(zhì)［11-13］，利用OAV技術(shù)研究了卷煙主流煙氣總粒相物中的煙熏香、酸香、清（青）特征成分等［14-17］。而基于OAV分析煙葉提取物致香成分對(duì)凸顯煙葉風(fēng)格特征的研究還鮮有報(bào)道，僅近期有文獻(xiàn)報(bào)道將OAV技術(shù)用于分析不同地區(qū)烤煙香氣差異［18］。因此，以福建尤溪煙葉提取物為研究對(duì)象，確定了35種主要致香成分并按香韻特征分為7種香韻特征賦予組群，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定了其在煙葉提取物中的濃度，借鑒食品領(lǐng)域香氣物質(zhì)在水中的嗅覺閾值，計(jì)算了相應(yīng)的OAV，比較了各香韻特征成分對(duì)各香韻特征組群的貢獻(xiàn)度，并利用卷煙加香評(píng)吸實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為加深對(duì)福建尤溪煙葉香韻風(fēng)格及其物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)，構(gòu)建煙葉提取物的致香成分與其香韻風(fēng)格特征的有效聯(lián)系提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

福建尤溪YLC01-2016煙葉由福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心提供。

95%乙醇、無水乙醇、二氯甲烷（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；內(nèi)標(biāo)：氘代萘、氘代蒽（≥98%，北京百靈威科技有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)品：己醛、糠醛、順-3-己烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、壬醛、麥芽酚（≥95%，北京伊諾凱科技有限公司），2-甲基-3-己酮、2（5H）-呋喃酮、6-甲基-2-庚酮、反，反-2，4-庚二烯醛、甲基環(huán)戊烯醇酮、氧化異佛爾酮、反，順-2，6-壬二烯醛（≥95%，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社），當(dāng)歸內(nèi)酯、6-甲基-3，5-庚二烯-2-酮、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草乙酮［≥97%，阿法埃莎（天津）化學(xué)有限公司］，γ-丁內(nèi)酯、5-甲基糠醛、苯甲醇、苯乙醛、2-乙?；量?、4-甲基苯乙酮、β-環(huán)檸檬醛、苯乙酸乙酯、β-環(huán)高檸檬醛、異丁香酚、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯（≥95%，北京百靈威科技有限公司），愈創(chuàng)木酚、香蘭素［≥99%，阿拉丁試劑（上海）有限公司］，苯乙醇、β-大馬酮、β-二氫大馬酮（≥95%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司），β-紫羅蘭酮（≥95%，美國(guó)Fluka公司）。

LECO Pegasus BT4D全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Leco公司）；GFL1041恒溫水浴鍋（德國(guó)GFL公司）；Hei-VAP Precision ML旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；AT261變量程電子天平（感量0.000 01 g，瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙葉浸膏制備

取100 g煙葉原料，裝入2 L圓底燒瓶中，加入1 000 g 95%乙醇，水浴80℃提取1 h；濾出第1次提取液后再加入1 000 g 95%乙醇，繼續(xù)水浴80℃提取1 h。合并兩次提取所得提取液，體系壓力5～14kPa、水浴溫度50℃下減壓濃縮，控制濃縮液密度在1.37～1.38 g/cm3之間。

1.2.2 分析樣品制備及定性分析條件

取8 g上述所制備的煙葉提取物，加入10 mL含內(nèi)標(biāo)物氘代蒽、氘代萘（濃度均為4 μg/mL）的二氯甲烷溶液，充分振蕩20 min，靜置后取上層清液并常溫減壓濃縮（體系壓力20 kPa）至1.5 mL。進(jìn)行全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（GC×GC-TOF MS）分析。檢測(cè)條件：

色譜柱一：Rtx-5SIL MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色譜柱二：Rxi-17SIL MS（1.5 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序；載氣：He，恒流，1.4 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；調(diào)制周期：4 s；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣模式：分流進(jìn)樣；分流比：10∶1。離子化方式：EI；離子源溫度：250℃；傳輸線溫度：260℃；EI電離能量：70 eV；溶劑延遲時(shí)間：3 min；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：45～450 amu。

采用直接進(jìn)樣方式進(jìn)行檢測(cè)，利用NIST標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)對(duì)各色譜峰進(jìn)行自動(dòng)檢索。從檢索結(jié)果中挑選正向、反向檢索匹配度均大于或等于80%的致香成分。

1.2.3 煙葉提取物各香韻特征成分的定量分析

使用內(nèi)標(biāo)法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)煙葉中的各香韻特征成分進(jìn)行定量分析，分析條件與方法同1.2.2節(jié)，以各目標(biāo)物的濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度之比為橫坐標(biāo)，分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 致香成分嗅覺閾值的確定和OAV的計(jì)算

在化學(xué)成分復(fù)雜且相互影響的煙葉提取物中，尚未找到合適的體系或介質(zhì)測(cè)定致香成分的嗅覺閾值，本研究中借鑒食品領(lǐng)域中香氣物質(zhì)在水中的嗅覺閾值來代表其實(shí)際的嗅覺閾值［16-17］。致香成分在水中的嗅覺閾值（Olfactory threshold，OT）數(shù)據(jù)主要來源于文獻(xiàn)［19］，優(yōu)先使用最新年份的閾值數(shù)據(jù)［17］；未在文獻(xiàn)中查找到嗅覺閾值的致香成分，依據(jù) GB/T 22366—2008［20］的方法測(cè)定其在水中的嗅覺閾值。按照公式（1）計(jì)算OAV：

式中：C為致香成分在香氣體系中的質(zhì)量濃度，μg/mL；OT為致香成分在水中的嗅覺閾值，μg/mL。

1.2.5 煙葉提取物及其香韻特征成分復(fù)配物的質(zhì)量風(fēng)格特色感官評(píng)價(jià)

用香精注射機(jī)將煙葉提取物和復(fù)配物按0.01%的比例均勻添加至參比卷煙中，將得到的樣品煙支置于（22±1）℃和相對(duì)濕度（60±2）%的環(huán)境中平衡48 h。由福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心10名具有省級(jí)及以上卷煙感官評(píng)價(jià)資質(zhì)的評(píng)委參照YC/T 530—2015［21］的方法對(duì)參比卷煙和樣品卷煙進(jìn)行對(duì)比評(píng)吸。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙葉提取物致香成分定性分析結(jié)果

煙葉提取物的GC×GC-TOF MS定性分析共鑒定出73種揮發(fā)性致香成分（表1）。

表1 煙葉提取物致香成分的定性分析結(jié)果Tab.1 Results of qualitative analysis of aroma components in tobacco leaf extracts

表1（續(xù)）

2.2 煙葉提取物各香韻特征成分的確定

對(duì)定性分析出的73種致香成分進(jìn)行篩選，主要依據(jù)是化合物的商品化性（例如反-2-癸烯醛、2，4-癸二烯醛、茄酮、巨豆三烯酮等未購(gòu)買到合適標(biāo)準(zhǔn)品，不排除其對(duì)香韻特征有重要貢獻(xiàn)）、安全性要求［22-23］等因素，最終篩選出35種香韻特征成分（表2），其香氣特征描述和香韻歸類方式主要參考相關(guān)文獻(xiàn)［17，24-25］進(jìn)行，將35種致香成分按清香、青滋香、花香、果香、焦甜香、豆香和辛香7種香韻進(jìn)行歸類，其特征成分分別為11、2、6、3、5、4和4種。從表2可知，許多致香成分兼具其他香韻，例如6-甲基-5-庚烯-2-酮兼有清香和果香，以清香為主；麥芽酚兼有焦甜香和果香，以焦甜香為主。

表2 各香韻特征成分的確定及其香氣特征描述Tab.2 Determination of characteristic aroma components and their aroma description

2.3 煙葉提取物各香韻特征成分定量分析

采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)35種致香成分定量測(cè)定的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表3所示，在線性范圍內(nèi)工作曲線線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998。并采用此方法分別檢測(cè)了上述35種香韻特征成分在煙葉提取物中的量。

從表3可知，11種清香特征成分的總量為56.71 μg/mL，其中氧化異佛爾酮未檢出，香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮的量較高，其余成分的量均較低；2種青滋香特征成分的總量為0.88 μg/mL，順-3-己烯醛的量大于反，順-2，6-壬二烯醛；3種果香特征成分的總量為3.83 μg/mL，己醛的量最高；6種花香特征成分的總量為23.85 μg/mL，其中苯甲醇和2-乙?；量┑牧枯^高；5種焦甜香特征成分的總量為17.84 μg/mL，2（5H）-呋喃酮和糠醛的量較高；4種辛香特征成分的總量為10.76 μg/mL，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的量最高；5種豆香特征成分的總量為14.48 μg/mL，其中γ-丁內(nèi)酯和4-甲基苯乙酮的量較高。

實(shí)際上，香氣化合物濃度和香氣強(qiáng)度并非簡(jiǎn)單的正比關(guān)系，還需結(jié)合嗅覺閾值得到香氣活性值來綜合考察其對(duì)煙葉風(fēng)格特征的整體貢獻(xiàn)［14-17］。

2.4 煙葉提取物香韻特征成分的貢獻(xiàn)度分析

利用OAV值可從濃度和閾值兩個(gè)維度上揭示香氣成分對(duì)香氣體系的貢獻(xiàn)度［7］。在食品風(fēng)味分析中，通常OAV＞1的香氣成分被認(rèn)為對(duì)整體香氣具有一定的貢獻(xiàn)度，其值越大，貢獻(xiàn)度越大。煙葉提取物各香韻特征成分的OAV結(jié)果如表4所示?？芍?，10種清香特征成分中，除反，反-2，4-庚二烯醛外，其余9種成分的OAV均大于1，說明這9種成分對(duì)清香香韻均有貢獻(xiàn)。β-大馬酮和β-二氫大馬酮的量之和為0.77 μg/mL，僅占清香特征成分總量的1.37%，但由于其嗅覺閾值最小，所以兩者OAV之和幾乎等于所有清香特征成分OAV之和；而香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮的量之和占清香特征成分總量的94.06%，但其嗅覺閾值相對(duì)較大，因而OAV較前兩者低。綜合分析，β-大馬酮和β-二氫大馬酮對(duì)清香香韻的作用更重要。據(jù)文獻(xiàn)［16］報(bào)道，在研究玉溪C3F煙葉清香風(fēng)格特征時(shí)發(fā)現(xiàn)β-大馬酮和β-二氫大馬酮在彰顯煙氣清香香韻時(shí)起主要作用。這表明兩者結(jié)果能相互印證。2種青滋香特征成分濃度均很低，但嗅覺閾值均較小，因此OAV較高。3種果香特征成分對(duì)果香香韻均有貢獻(xiàn)，其中己醛的貢獻(xiàn)最大，其次是6-甲基-2-庚酮。6種花香特征成分中，盡管苯甲醇和2-乙?；量┱妓谢ㄏ闾卣鞒煞挚偭康?9.20%，但其嗅覺閾值均較高，兩者OAV之和僅為0.56；苯乙醛和β-紫羅蘭酮的OAV遠(yuǎn)大于苯乙醇和苯乙酸乙酯，在彰顯花香香韻時(shí)的作用更重要。同理，甲基環(huán)戊烯醇酮和麥芽酚（焦甜香）、愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（辛香）、4-甲基苯乙酮（豆香）在彰顯各自香韻時(shí)均起到更重要的作用。

表3 煙葉提取物中35種香韻特征成分的工作曲線與濃度分布Tab.3 Working curves and concentration distribution of 35 aroma characteristic components in tobacco leaf extracts

從各香韻特征組群的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和OAV分布圖（圖1）可知，清香特征組群的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和OAV分布均是最多的，其次是花香特征組群，而果香、焦甜香、辛香和豆香特征組群的質(zhì)量分?jǐn)?shù)盡管均遠(yuǎn)比青滋香特征組群大，但OAV分布卻小于后者。煙葉提取物香韻特征組群的OAV分析結(jié)果顯示其香韻風(fēng)格是清香為主，輔以花香、青滋香、果香、焦甜香、辛香和豆香等香韻，整體來看香韻分析結(jié)果與文獻(xiàn)［2］報(bào)道的福建尤溪煙葉的香韻風(fēng)格基本吻合。綜上可知，基于香氣活性值的香韻特征組群分析驗(yàn)證煙葉提取物香韻風(fēng)格特征是可行的。

由于煙葉提取物的致香成分?jǐn)?shù)量較多，本研究中僅測(cè)得了34種香韻特征成分的OAV，且存在無標(biāo)準(zhǔn)品而無法測(cè)定OAV的情況；另外，各致香成分之間的交叉影響也未考慮。

表4 各香韻特征成分的香氣活性值Tab.4 Odor activity values of aroma characteristic components

2.5 煙葉提取物及其香韻特征成分復(fù)配物在卷煙中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

基于福建尤溪煙葉提取物香韻特征成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)與OAV分析結(jié)果，將OAV＞1的成分按照定量結(jié)果進(jìn)行復(fù)配，得到的煙葉提取物香韻特征成分復(fù)配物和煙葉提取物按相同條件進(jìn)行卷煙加香評(píng)價(jià)，其主要香韻特征的感官評(píng)分值見圖2。

評(píng)吸結(jié)果表明：與空白卷煙相比，施加煙葉提取物的卷煙煙氣清甜香突出，蜜甜香明顯，花香微顯，香氣豐富，煙氣細(xì)膩柔和，口腔舒適度有所提升；施加煙葉提取物香韻特征成分復(fù)配物的卷煙煙氣具有類似尤溪煙葉的香韻特征，清甜香突出，蜜甜香和花香微顯，香氣質(zhì)、香氣量均有所改善，無明顯口腔與鼻腔刺激，但香韻豐富程度較煙葉提取物低?；贠AV結(jié)果的煙葉提取物香韻特征成分復(fù)配物能賦予卷煙清甜香和花香香韻特征，能使香氣質(zhì)提高，同時(shí)不產(chǎn)生明顯的刺激性，提高了卷煙抽吸品質(zhì)。

圖1 各香韻特征組群的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和OAV分布圖Fig.1 Contents and OAV distribution of aroma characteristic groups

圖2 煙葉提取物及其香韻特征成分復(fù)配物的主要香韻特征感官評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.2 Results of sensory evaluation of main aroma characteristics of tobacco leaf extracts and combination of their aroma characteristics components

3 結(jié)論

（1）福建尤溪煙葉中，10種清香、2種青滋香、3種果香、6種花香、5種焦甜香、4種辛香和4種豆香特征成分的總量分別為 56.71、0.88、3.83、23.85、17.84、10.76和 14.48 μg/mL，其中香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和6-甲基-5-庚烯-2-酮（清香），己醛（果香），苯甲醇和2-乙酰基吡咯（花香），2（5H）-呋喃酮和糠醛（焦甜香），4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（辛香），γ-丁內(nèi)酯和4-甲基苯乙酮（豆香）在各自香韻中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

（2）在煙葉中彰顯各自香韻特征中起重要作用的成分有β-大馬酮和β-二氫大馬酮（清香）、順-3-己烯醛和反，順-2，6-壬二烯醛（青滋香）、己醛（果香）、苯乙醛和β-紫羅蘭酮（花香）、甲基環(huán)戊烯醇酮和麥芽酚（焦甜香）、愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（辛香）、4-甲基苯乙酮（豆香）。福建尤溪煙葉提取物的香韻風(fēng)格是清香為主，輔以花香、青滋香、果香、焦甜香、辛香和豆香等，與文獻(xiàn)［2］報(bào)道的福建尤溪煙葉香韻風(fēng)格基本吻合?；贠AV分析結(jié)果的煙葉提取物香韻特征成分復(fù)配物能夠賦予卷煙清甜香、蜜甜香和花香香韻特征，香氣質(zhì)提高。