活血補(bǔ)腎壯骨方對(duì)GIOP型大鼠骨折愈合的作用及對(duì)骨密度、血清堿性磷酸酶和骨鈣素水平的影響*

段 碩 鄧丹華 陳 磊 魏迎亮

（1.遼寧省沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110044；2.遼寧省丹東市聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六六醫(yī)院，遼寧 丹東 118000；3.遼寧省沈陽(yáng)二〇四醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110043；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng)110004）

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松（GIOP）是指長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素（GC）治療疾病而引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨強(qiáng)度下降為主要特征的一種代謝性疾病，發(fā)病率較高，僅次于絕經(jīng)后和老年性骨質(zhì)疏松［1］。GIOP易并生骨折，且愈合困難，致殘率較高。目前臨床對(duì)GIOP的治療無(wú)特效方法，而GC又因其強(qiáng)大的藥理作用被廣泛應(yīng)用于臨床上，很多患者必須長(zhǎng)期甚至終生使用，因此，尋求有效防治GIOP的方法是臨床亟待解決的問(wèn)題?；钛a(bǔ)腎壯骨方是沈陽(yáng)市骨科醫(yī)院協(xié)定處方，有補(bǔ)腎壯骨、活血化瘀之功效。本研究通過(guò)肌內(nèi)注射地塞米松誘導(dǎo)建立GIOP大鼠模型，

采用活血補(bǔ)腎壯骨方干預(yù)，旨在探討活血補(bǔ)腎壯骨方對(duì)GIOP模型大鼠骨折愈合的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只清潔級(jí)雄性SD大鼠，7～8周齡，平均體質(zhì)量（250±20）g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2018-0002。室溫20～25℃、相對(duì)濕度40%～50%下飼養(yǎng)，通風(fēng)環(huán)境良好，自由飲水進(jìn)食。

1.2 試藥與儀器 活血補(bǔ)腎壯骨方組成：杜仲15 g，骨碎補(bǔ)15 g，淫羊藿15 g，淮山藥15 g，菟絲子15 g，紫丹參10 g，當(dāng)歸10 g，紅花10 g，茯苓10 g，龍骨 15 g，獨(dú)活10 g，續(xù)斷10 g，熟地黃20 g，川芎10 g，牛膝 10 g，甘草10 g；飲片均由本醫(yī)院藥房提供并煎煮，藥材加水煎煮2次，生藥質(zhì)量濃度1 mg/mL。地塞米松磷酸鈉注射液（廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號(hào)1902067，規(guī)格：1 mL∶5 mg）；阿侖膦酸鈉（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)上海海尼藥業(yè)有限公司，批號(hào)1903182，規(guī)格：10 mg/片）；水合氯醛（分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（TrACP）、Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基端肽（CTX-1）、堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OC）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。PDiscovery QDR型雙能X線骨密度儀（美國(guó)Hologic公司）；ElectroForce 3200生物材料實(shí)驗(yàn)儀（美國(guó)Instron公司）；J-D200生物顯微鏡（深圳拓天儀器設(shè)備有限公司）；TE2000型熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；計(jì)算機(jī)X射線攝像儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）；OLYMPUS BX-51型骨組織形態(tài)計(jì)量?jī)x（美國(guó)BIOQUANT公司）。

1.3 分組與造模 隨機(jī)法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為空白組10只、造模組50只，造模組又分模型組、西藥組，中藥組（活血補(bǔ)腎壯骨方）低劑量、中劑量、高劑量各10只。建模前1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，除空白組外，其余大鼠均大腿部肌內(nèi)注射地塞米松磷酸鈉注射液，劑量1 mg/kg，每日1次，每周3次，每周稱1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整劑量，連續(xù)注射9周。骨密度下降提示造模成功。9周后，按照閉合骨折模型方法，采用骨髓內(nèi)針固定法行大鼠左側(cè)股骨骨折。3.5%水合氯醛（10 μL/g）腹腔麻醉，自左股骨髁間凹處，垂直穿入直徑1.0 mm克氏針達(dá)髓腔，拔出克氏針，在股骨中段以拇指為支點(diǎn)，用較緩和的力量徒手折骨，當(dāng)感到骨折時(shí)，停止用力，避免骨折移位，克氏針從原穿針點(diǎn)進(jìn)針，穿針到骨折遠(yuǎn)端，針尾埋于皮下，多余部分剪除，局部消毒后歸籠。術(shù)后3 d常規(guī)抗感染處理，肌內(nèi)注射青霉素100萬(wàn)U/kg。X線顯示左股骨骨折，對(duì)位良好，髓內(nèi)針固定在位，造模成功。建模未成功：空白組、模型組和中藥中、高劑量組各1只，西藥組、中藥低劑量組各2只。

1.4 干預(yù)方法 術(shù)后第2天空白組和模型組給予生理鹽水灌胃，劑量5 mg/kg；西藥組給予阿侖膦酸鈉5 mg/kg灌胃；中藥組給予活血補(bǔ)腎壯骨方灌胃，低劑量組2.5 mg/kg、中劑量組5 mg/kg、高劑量組7.5 mg/kg；每天灌胃1次，連續(xù)10周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)測(cè)定：心臟取血，離心，取上層血清，采用試劑盒檢測(cè)TrACP、CTX-1、ALP、OC水平，嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。骨密度測(cè)定：大鼠處死后無(wú)菌條件下剝離左側(cè)股骨，剔除軟組織，4℃避光保存在70%乙醇中，以雙能X線骨密度儀測(cè)量股骨的骨密度（BMD）、組織骨密度（TMD），掃描2 cm階段。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)檢測(cè)：截取剝離的左側(cè)股骨遠(yuǎn)端干骺端組織，應(yīng)用骨組織形態(tài)計(jì)量?jī)x測(cè)定骨組織形態(tài)參數(shù)，包括骨小梁面積百分?jǐn)?shù)（TbAr%）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）。骨生物力學(xué)測(cè)量：剝離的左側(cè)股骨用生理鹽水紗布包裹置于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。股骨解凍后行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，支點(diǎn)跨距為20 mm，中央垂直（股骨與載荷成90°角）施加載荷，速率2 mm/min，測(cè)量并計(jì)算最大載荷、最大撓度和最大應(yīng)力。骨組織染色：將大鼠股骨組織分離，取股骨上端標(biāo)本，4%多聚甲醛固定24 h，脫鈣液充分脫鈣1個(gè)月，每周更換1次。石蠟包埋，制作切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示，組間或組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)數(shù)資料的比較，以n（%）表示計(jì)數(shù)資料。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)比較 見表1。與空白組比較，模型組血清TrACP、CTX-1均明顯升高，ALP、OC均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠TrACP、CTX-1均明顯降低，ALP、OC均明顯升高（P＜0.05）；與西藥組比較，高劑量組各指標(biāo)均明顯改善（P＜0.05）。

表1 各組大鼠骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠骨轉(zhuǎn)化指標(biāo)比較（±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05；與西藥組比較，△P＜0.05。下同

組別空白組模型組西藥組低劑量組中劑量組高劑量組n 9 9 8 8 9 9 TrACP（ng/mL）43.49±1.21 54.65±3.93*47.04±2.02*▲49.63±2.78*▲46.85±1.86*▲44.48±1.63▲△CTX-1（μmol/L）10.35±3.19 193.31±43.42*30.27±4.36*▲34.17±4.88*▲26.74±4.03*▲21.52±3.41▲△ALP（pg/mL）59.86±1.47 40.07±1.45*51.74±1.29*▲48.75±1.32*▲53.68±1.26*▲57.59±1.02▲△OC（pg/mL）337.20±26.78 239.97±30.26*291.46±20.53*▲278.82±18.39*▲300.28±21.64*▲311.28±17.71▲△

2.2 各組大鼠腦骨密度比較 見表2。與空白組比較，模型組BMD、TMD均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠BMD、TMD均顯著增加（P＜0.05）；與西藥組比較，高劑量組BMD、TMD增加明顯（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦骨密度比較（g/cm3，±s）

表2 各組大鼠腦骨密度比較（g/cm3，±s）

組別空白組模型組西藥組低劑量組中劑量組高劑量組n998899 BMD 0.38±0.03 0.23±0.02*0.29±0.02*▲0.27±0.02*▲0.31±0.01*▲0.34±0.02▲△TMD 0.85±0.02 0.73±0.01*0.79±0.02*▲0.77±0.01*▲0.80±0.02*▲0.82±0.02▲△

2.3 各組大鼠股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)比較 見表3。與空白組比較，模型組TbAr%、Tb.N、Tb.Th明顯減少，Tb.Sp明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠TbAr%、Tb.N、Tb.Th明顯增加，Tb.Sp明顯減少（P＜0.05）；與西藥組比較，高劑量組各指標(biāo)顯著改善（P＜0.05）。

表3 各組大鼠股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠股骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)比較（±s）

組別空白組模型組西藥組低劑量組中劑量組高劑量組n 9 9 8 8 9 9 TbAr%23.35±5.78 15.59±4.41*20.03±5.16*▲18.97±5.42*▲20.54±5.17*▲21.79±6.18▲△Tb.N（個(gè)/mm2）5.69±0.42 4.28±0.63*5.11±0.45*▲4.93±0.54*▲5.16±0.48*▲5.32±0.46▲△Tb.Th（μm）79.36±8.57 50.71±9.32*64.82±7.91*▲60.26±8.13 68.34±8.38*▲71.49±7.48▲△Tb.Sp（mm）0.20±0.01 0.31±0.03*0.25±0.02*▲0.26±0.01*▲0.23±0.02*▲0.22±0.01▲△

2.4 各組大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)比較 見表4。與空白組比較，模型組最大載荷、最大撓度、最大應(yīng)力均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組最大載荷、最大撓度、最大應(yīng)力均明顯升高（P＜0.05），與西藥組比較，高劑量組各指標(biāo)均升高明顯（P＜0.05）。

表4 各組大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表4 各組大鼠骨生物力學(xué)指標(biāo)比較（±s）

組別空白組模型組西藥組低劑量組中劑量組高劑量組n 9 9 8 8 9 9最大載荷（N）150.06±19.85 124.64±16.96*134.58±17.17*▲135.88±16.21*▲138.23±16.16*▲142.63±17.82▲△最大撓度（mm）1.82±0.33 1.27±0.24*1.48±0.31*▲1.49±0.28*▲1.56±0.26*▲1.69±0.27▲△最大應(yīng)力（MPa）13.96±0.54 9.58±0.69*10.65±0.44*▲10.39±0.41*▲11.04±0.58*▲11.29±0.47▲△

2.5 各組大鼠骨組織形態(tài)比較 見圖1。模型組骨小梁明顯變細(xì)、稀疏；各治療組大鼠骨小梁較模型組明顯增加。

圖1 各組大鼠骨組織形態(tài)比較（HE染色，100倍）

3 討論

GIOP屬于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，GC可直接作用于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，通過(guò)促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，延長(zhǎng)其生存時(shí)間以促進(jìn)骨吸收，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡、抑制成骨細(xì)胞分化和降低成骨功能等以抑制骨形成，同時(shí)抑制Ⅰ型膠原合成，阻礙其與非膠原蛋白結(jié)合，使骨丟失加快、骨增殖能力下降，最終引起骨質(zhì)疏松。骨折是骨質(zhì)疏松的常見并發(fā)癥之一，GIOP患者在服用GC的3～6個(gè)月內(nèi)，骨折發(fā)生率明顯增加［2］，多見于椎骨、腕部及髖部，以髖部骨折發(fā)生率最高。

骨代謝評(píng)價(jià)包括骨量和骨質(zhì)量?jī)蓚€(gè)主要方面。骨密度是反映骨量的有效指標(biāo)，與骨折危險(xiǎn)程度密切相關(guān)，也是診斷骨質(zhì)疏松的必要條件［3］。CTX-1是Ⅰ型膠原的降解產(chǎn)物，所具有的特異性結(jié)構(gòu)使其在血清中有較佳的穩(wěn)定性，因此，血清CTX-1水平能特異性反映破骨細(xì)胞的吸收活性［4］。TrACP是由破骨細(xì)胞分泌的非膠原蛋白，和膠原代謝產(chǎn)物一起被分泌到細(xì)胞外，故TrACP與骨吸收水平成正相關(guān)［5］。ALP和OC均由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，前者是總堿性磷酸酶的重要組成部分，后者是骨基質(zhì)中含量最豐富的標(biāo)志物，二者均反映骨形成狀態(tài)［6-7］。骨組織形態(tài)學(xué)是研究骨組織結(jié)構(gòu)和骨量等靜態(tài)特性；骨生物力學(xué)則是骨強(qiáng)度、骨結(jié)構(gòu)、骨量的綜合體現(xiàn)，其中骨結(jié)構(gòu)力學(xué)強(qiáng)度是反映骨質(zhì)疏松性骨折風(fēng)險(xiǎn)的最有效指標(biāo)，三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)是常用的測(cè)量方法，最大載荷反映骨的剛度，最大應(yīng)力反映骨質(zhì)的內(nèi)在硬度。骨生物力學(xué)性能降低是骨折發(fā)生的重要原因之一，同時(shí)也是評(píng)價(jià)藥物治療骨質(zhì)疏松療效的重要指標(biāo)［8］。

在中醫(yī)學(xué)上，GIOP 屬于“骨痿”“骨痹”“骨枯”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松的發(fā)病以腎虛為本，病機(jī)為腎虛精虧，骨空失養(yǎng)，陰陽(yáng)兩虛；治療原則以補(bǔ)腎壯骨填精為主，補(bǔ)肝脾、活血化瘀為輔［9］。本方中淫羊藿、菟絲子、杜仲補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、益精壯陽(yáng)；續(xù)斷、骨碎補(bǔ)補(bǔ)肝腎、強(qiáng)骨壯筋、續(xù)折傷；熟地黃補(bǔ)血養(yǎng)陰、填精益髓；丹參、紅花、當(dāng)歸、牛膝活血化瘀、通經(jīng)止痛；山藥補(bǔ)脾益腎；茯苓健脾安神；龍骨鎮(zhèn)心安神，平肝潛陽(yáng)；川芎活血散瘀，祛風(fēng)止痛；獨(dú)活通痹止痛；甘草補(bǔ)脾氣、調(diào)和諸藥，全方共奏補(bǔ)腎壯骨、活血化瘀之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)［10-11］：牛膝總皂苷可升高骨質(zhì)疏松大鼠堿性磷酸酶活性和血清骨鈣素水平，改善骨代謝；骨碎補(bǔ)總黃酮能提高血鈣、血磷水平，激活成骨細(xì)胞，明顯增加骨小梁寬度和密度，減少骨小梁間隙［12］；杜仲可降低骨折早期的血鈣水平，升高血磷，促進(jìn)骨折斷端礦物質(zhì)沉積，促進(jìn)骨痂生長(zhǎng)和骨折愈合；續(xù)斷可以調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收指標(biāo)，降低骨轉(zhuǎn)換率，增加骨密度，改善骨小梁微結(jié)構(gòu)，提高股骨強(qiáng)度，降低骨折風(fēng)險(xiǎn)；丹參可預(yù)防骨質(zhì)疏松，以預(yù)防松質(zhì)骨為主，可顯著增加BMD，降低磷含量［13-16］。

在本研究中，各治療組大鼠TrACP、CTX-1、Tb.Sp均明顯降低，ALP、OC、BMD、TMD、TbAr%、Tb.N、Tb.Th、最大載荷、最大撓度、最大應(yīng)力均明顯升高；活血補(bǔ)腎壯骨方高劑量組各項(xiàng)指標(biāo)均改善明顯。因此我們認(rèn)為，活血補(bǔ)腎壯骨方能顯著升高GIOP大鼠的血清ALP、OC含量，降低TrACP、CTX-I水平，增加BMD、Tb.N縮小骨小梁間隙，改善骨顯微結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)骨強(qiáng)度，提升骨生物力學(xué)性能，從而有效促進(jìn)骨折愈合，對(duì)抗糖皮質(zhì)激素的致骨質(zhì)疏松作用，改善GIOP癥狀，保護(hù)骨組織。