基于網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)的痰熱清膠囊治療新冠肺炎的物質(zhì)基礎(chǔ)及機制研究*

韋祖猛 黃衛(wèi)清 趙寧波 廖金花 彭雙鳳 凌 利 徐麗麗△ 李 林△

（1.江西中醫(yī)藥大學，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006；3.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 201401）

新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）由β屬冠狀病毒的2019-nCoV感染引起［1］，可通過呼吸道飛沫、密切接觸以及氣溶膠傳播。目前新冠肺炎大流行正以指數(shù)級速度增長，被世界衛(wèi)生組織（WHO）列為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。目前還未有對COVID-19的特效抗病毒藥物，而中藥成分多樣，具有多靶點、整體調(diào)節(jié)的獨特優(yōu)勢，臨床反饋提示中醫(yī)藥治療新冠肺炎療效顯著［2］。痰熱清膠囊是由上海凱寶藥業(yè)股份有限公司研制的中成藥制劑，由5味中藥組成，其中黃芩為君藥，性苦寒，清肺熱，燥濕解毒；熊膽粉和山羊角為臣藥，具有清熱解毒、息風止痙、祛痰平喘等作用；金銀花和連翹為佐使藥以助清熱解毒、宣透散邪［3］。在抗擊新冠肺炎疫情中，痰熱清注射液在國家衛(wèi)生健康委、國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的第六版、第七版診療方案中被納入重癥、危重癥推薦用藥，而痰熱清膠囊則在部分省市的診療方案中被列為輕癥推薦用藥［4-5］。目前由上海市公共衛(wèi)生臨床中心負責的《痰熱清膠囊治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）臨床試驗》（注冊號ChiCTR2000029813）正在進行，以評價痰熱清膠囊治療新冠肺炎有效性及安全性。本研究擬借助于網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接的研究方法對痰熱清膠囊治療新冠肺炎的潛在活性成分及作用機制進行預(yù)測，以期為該藥治療新冠肺炎提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 痰熱清膠囊主要活性成分篩選 在CNKI、萬方、維普及中國生物醫(yī)學數(shù)據(jù)庫中以“痰熱清膠囊”以及主要組成藥物為主題，“活性成分”為全文搜索關(guān)鍵詞，檢索痰熱清膠囊已見于文獻報道的化學成分。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索藥物成分的2D分子結(jié)構(gòu)，以SDF格式保存，構(gòu)建痰熱清膠囊小分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。將分子結(jié)構(gòu)的SDF文件導入SwissADME平臺（http：//www.swissadme.ch/）進行類藥性及口服生物利用度分析。同時，結(jié)合文獻報道中經(jīng)實驗證實具有藥理活性的藥物組分，經(jīng)分析后獲取痰熱清膠囊的主要活性成分。

1.2 主要成分及疾病靶點預(yù)測 將成分分子結(jié)構(gòu)的SDF文件導入SwissTargetPrediction平臺（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進行成分靶點預(yù)測，獲取藥物成分靶點。在 GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中以“Novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞檢索疾病相關(guān)的基因。

1.3 藥物-成分-靶點通路及核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建運用R語言將主要活性成分的相關(guān)靶標蛋白基因名稱進行統(tǒng)一。經(jīng)Excel2019規(guī)范處理后導入Cytoscape3.7.0構(gòu)建藥物、成分、靶點互助網(wǎng)絡(luò)。將藥物與疾病的交集靶點導入String11.0數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org/）獲取靶標蛋白互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，并借助Cytoscape3.7.0軟件進行可視化。

1.4 核心靶點通路分析 為進一步了解核心靶點基因的功能和痰熱清膠囊治療病毒性肺炎的主要作用通路，借助R語言對藥物成分靶點與疾病相關(guān)基因取交集。然后將交集基因輸入Metascape平臺（https：//metascape.org/gp/index.html）的“Multiple Gene list”的功能界面，物種選定為“H.sapiens（human）”，進行 GO功能注釋及KEGG通路富集分析，結(jié)果借助R語言可視化。

1.5 分子對接 冠狀病毒的3CL水解酶為冠狀病毒的主要蛋白酶之一，與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，可作為藥物設(shè)計的關(guān)鍵靶標［6］。目前上?？萍即髮W饒子和、楊海濤課題組公布了COVID-19 3CL水解酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)（PDB 6LU7）。本研究從PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載該晶體結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu)，利用PyMol軟件對蛋白進行去水，分離原配體的處理后，在AutoDockTools完成蛋白和原配體的加氫，計算電荷，保存為相應(yīng)的PDBQT結(jié)構(gòu)文件。從Pubchem下載痰熱清膠囊主要成分及瑞德西韋及氯喹的二維結(jié)構(gòu)的sdf文件，通過ChemBioDraw3D軟件將其全部轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)的MOL2格式文件。借助AutoDockTools軟件對MOL2格式的小分子進行加氫，計算電荷，加Root處理后，保存為對接必備的PDBQT結(jié)構(gòu)文件，完成配體的準備工作。對于3CL水解酶蛋白活性口袋的位置，借助POCASA 1.1平臺（http：//altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/）基于滾動探針球的蛋白口袋識別算法進行預(yù)測，獲得可能性最高的5種預(yù)測結(jié)果，從中選取與蛋白原配體坐標重合度最高的口袋位置。最后運行AutoDock進行對接，取能量最低的構(gòu)象為最優(yōu)構(gòu)象，并以3CL水解酶與原配體返回對接結(jié)果為陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選及靶點預(yù)測 見表1。文獻檢索共納入87個藥物成分［7］，經(jīng)SwissADME平臺篩選后，共獲得痰熱清膠囊的主要活性成分26個，其中黃芩苷、綠原酸及其異構(gòu)體口服利用度雖較低，但仍以主要化合物而得以保留。將候選成分的2D分子結(jié)構(gòu)導入SwissTargetPrediction平臺進行靶蛋白預(yù)測，共獲得相關(guān)靶標蛋白293個。

2.2 藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò) 見圖1。藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)共有324個節(jié)點和757條邊。網(wǎng)絡(luò)拓撲學分析顯示的平均度值為4.67、平均最短路徑3.5，平均相鄰節(jié)點數(shù)4.6，網(wǎng)絡(luò)集中度0.3。度值表示預(yù)測出該成分與作用靶點的關(guān)聯(lián)個數(shù)，度值越大說明該成分越重要。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)大于平均度值的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的有68個，其中藥物成分26個，靶點42個；度值排名前10的化合物包括：黃芩素、異綠原酸C、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸、異綠原酸B、咖啡酸、亮氨酸、苯丙氨酸、膽酸、木樨草苷。此外，度值大于15的化合物還包括既往文獻報道的主要化合物如黃芩苷、連翹苷。排名前10的靶點包括：AKR1B1、AKR1B10、CA2、CA12、MMP2、ADORA1、CA7、PTGS2、ADRA2A、NOX4。

表1 痰熱清膠囊主要成分

圖1 藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 痰熱清膠囊治療新冠肺炎PPI互作網(wǎng)絡(luò) 見圖2～圖3，表2。根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點，得到259個靶點。運用R語言將主要活性成分的調(diào)控靶點與疾病靶點取交集，得到26個痰熱清膠囊治療新冠肺炎的靶點。將26個靶點基因?qū)隨tring平臺進行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，核心網(wǎng)絡(luò)圖包含26個節(jié)點，174條邊，其中節(jié)點表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系，線條越多表示關(guān)聯(lián)度越大。靶蛋白平均節(jié)點度值為10，超過平均度值的靶蛋白有15個，說明這15個靶蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點。痰熱清膠囊的藥理作用很可能是通過作用于這些靶點得以發(fā)揮，將度值由高到低排序。

圖2 痰熱清膠囊與新冠肺炎靶點（Vene圖）

圖3 痰熱清膠囊與新冠肺炎核心靶蛋白（PPI網(wǎng)絡(luò)圖）

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶標蛋白

2.4 核心靶點通路分析 見圖4。將上述得到的26個交集靶點導入Metascape平臺進行GO及KEGG功能富集分析，所得結(jié)果經(jīng)R語言可視化處理（見圖4A），KEGG通路富集篩選獲得前19條相關(guān)通路，涉及PI3K-Akt信號通路、人乳頭瘤病毒感染、MAPK信號通路、甲型流感、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、TNFα信號途徑、T細胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路等。GO功能富集分析后獲得相關(guān)條目50條（見圖4B、C、D）。GO-BP涉及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、病毒生命周期、病毒入侵宿主細胞、免疫反應(yīng)激活、T細胞活化、中性粒細胞介導免疫、免疫反應(yīng)中細胞因子分泌的調(diào)節(jié)、MAPK級聯(lián)調(diào)節(jié)等。GO-CC涉及膜筏、細胞質(zhì)核周區(qū)、溶酶體、質(zhì)膜外側(cè)、細胞-基質(zhì)粘附連接等。GO-MF涉及病毒受體活性、受體配體活性、細胞因子受體結(jié)合、MAP激酶活性、磷脂酰肌醇3激酶活性等。

圖4 KEGG富集分析（A）、GO生物學過程分析（B）、GO細胞組分分析（C）、GO分子功能分析（D）

2.5 分子對接結(jié)果 見表3。一般認為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量最低，發(fā)生的作用可能性最大。分子對接結(jié)果顯示，原配體的最優(yōu)結(jié)合能為-6.77 kcal/mol，瑞德西韋及氯喹的結(jié)合能分別為-7.46、-7.04 kcal/mol。將網(wǎng)絡(luò)拓撲分析中度值大于15的藥物成分進行對接，其中結(jié)合能低于-8 kcal/mol藥物成分共有6個。

表3 代表性成分及臨床推薦化學藥物與2019-nCoV 3CL水解酶的結(jié)合能

3 討論

新冠肺炎傳染性強，傳播迅速，人群廣泛易感，屬于中醫(yī)學“疫病”范疇。目前學者普遍認為濕毒是本病的關(guān)鍵，同時極易變燥、化熱、傷陰，由于區(qū)位氣候的差異，又有濕溫、寒濕、濕毒夾燥等證候特點［8-10］。痰熱清膠囊具有燥濕解毒、清熱化痰、宣散透邪之效，可用于風溫肺熱、濕毒為甚患者的辨證用藥。

本研究運用分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸、蘆丁、鵝去氧膽酸、漢黃芩苷、木樨草苷、黃芩苷的結(jié)合能普遍低于原配體及臨床上推薦的抗病毒藥物瑞德西韋、氯喹，表明上述6個成分與COVID-19 3CL水解酶的結(jié)合能力較強，可抑制病毒的復(fù)制，發(fā)揮抗病毒作用。而GO生物學過程分析亦提示痰熱清膠囊的藥理作用涉及病毒生命周期、病毒入侵宿主細胞，細胞組分主要在細胞膜及細胞質(zhì)核周區(qū)，分子功能與病毒受體活性相關(guān)，表明痰熱清膠囊的抗病毒作用可能貫穿于病毒入侵、轉(zhuǎn)錄復(fù)制、播散等過程。有研究顯示黃芩素可通過抑制流感病毒的中后期mRNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制或抑制流感病毒的神經(jīng)氨酸苷酶的活性，降低病毒的毒力而發(fā)揮抗病毒作用［11］。黃芩苷作為黃芩的主要成分以及黃芩素在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，有抑菌、抗氧化、抗病毒的作用，有實驗發(fā)現(xiàn)黃芩苷可作用于甲型流感病毒的核蛋白轉(zhuǎn)錄過程，負性調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮抗病毒作用［12］。鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸熊膽粉水解提取物的主要成分，現(xiàn)代藥理表明其具有抑菌、抗病毒、消炎的作用［13］。木樨草苷作為金銀花的黃酮類有效成分，研究顯示對呼吸道合胞體病毒有很強的抗病毒活性［14］。

機體免疫系統(tǒng)過度激活及促炎因子大量釋放引發(fā)的“炎癥風暴”被認為是新冠肺炎重癥化的重要誘因［15］。PPI互助網(wǎng)絡(luò)顯示TNF-α及IL-2是痰熱清膠囊活性成分的重要靶點，KEGG通路富集分析涉及TNF-α、IL-17及NF-κB信號通路。其中TNF-α是重要的促炎癥因子［16］，IL-2被稱為T細胞生長因子（TCGF），對于調(diào)控體內(nèi)淋巴細胞功能和穩(wěn)態(tài)起重要作用［17］。蘆丁、綠原酸及其異構(gòu)體作為痰熱清膠囊中良好的抗氧化劑，可對抗炎癥過程中大量ROS釋放對肺組織的氧化損傷，同時抑制ROS對NF-κB的活化，減少促炎因子的釋放，起到抗炎作用［18-20］。此外GO生物過程分析還涉及T細胞活化、中性粒細胞介導免疫、免疫反應(yīng)中細胞因子分泌的調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)，亦可作為痰熱清膠囊調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)的佐證。

EGFR是受體酪氨酸激酶EerbB家族成員，目前認為在炎癥因子如TNF-α、IL17等的刺激下可導致EGFR磷酸化而激活下游的ERK、p38MAPK信號通路，上調(diào)黏蛋白5AC（MUC5AC）的表達，導致黏蛋白過度分泌，痰液黏稠度升高［21-22］。目前新冠肺炎患者遺體解剖報告指出死亡患者肺內(nèi)滲出性反應(yīng)明顯，肺腔內(nèi)見大量膠凍狀黏液痰［23］。有研究表明，黃芩的提取物且同為痰熱清膠囊有效成分的野黃芩苷（Scutellarin）可通過抑制由人中性粒細胞彈性蛋白酶（HNE）誘導的PKC-ERK信號傳導途徑激活，下調(diào)MUC5AC的表達，減少氣道黏膜黏液的分泌［23］。因此，推測痰熱清膠囊可能通過減少炎癥因子的釋放以及抑制EGFR、ERK、p38MAPK的活化而下調(diào)黏蛋白的表達從而減少滲出、降低痰液黏稠度，促進痰液排出。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接方法證實痰熱清膠囊通過多成分、多靶點、多通路治療新冠肺炎，其涉及的機制包括抗病毒、下調(diào)炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、調(diào)節(jié)氣道黏液分泌等，可為痰熱清膠囊治療新冠肺炎及下一步的實驗提供參考。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學及虛擬對接的局限性，后期還需通過體內(nèi)、體外實驗來驗證本次研究結(jié)果，以期為痰熱清膠囊治療新冠肺炎提供實驗依據(jù)。