結(jié)核分枝桿菌對(duì)德拉馬尼的耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

劉原園 初平 韓書婧 楊慧 魯潔

結(jié)核病是全球重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，日益增加的耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病(MDR-TB/XDR-TB)是結(jié)核病廣泛傳播的重要原因之一[1-2]。與對(duì)藥品敏感的結(jié)核病相比，MDR-TB的治療需要4～6種抗結(jié)核藥品聯(lián)合使用，其中也包括毒性更強(qiáng)但效力較弱的二線藥品，可使其治療時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2年，具有治愈率低、治療時(shí)間長(zhǎng)、死亡率高等特點(diǎn)[3-4]，同時(shí)XDR-TB的治療成功率也僅為44%[5]。近年來(lái)，抗結(jié)核藥品的研發(fā)取得了一些新的進(jìn)展。其中，德拉馬尼(delamanid，Dlm)首次獲得歐洲藥品管理局的批準(zhǔn)，被世界衛(wèi)生組織列入MDR-TB治療指南，可與標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核方案聯(lián)合用于成年MDR-TB患者[6-7]，為治療MDR-TB/XDR-TB帶來(lái)了希望。然而，Dlm作為新藥，其耐藥株的及時(shí)檢測(cè)對(duì)于最大限度地減少耐藥風(fēng)險(xiǎn)及保持藥品的有效性也是至關(guān)重要的。筆者對(duì)Dlm的耐藥機(jī)制及其耐藥相關(guān)基因突變進(jìn)行綜述，為Dlm耐藥株的早期分子檢測(cè)提供參考。

一、 Dlm的作用機(jī)制及抗菌活性

Dlm又稱為OPC-67683，是一種硝基二氫咪唑類衍生物，由日本大冢制藥有限公司研發(fā)。其作用機(jī)制主要是抑制分枝菌酸的生物合成，尤其是甲氧基分枝菌酸和酮類分枝菌酸[8]，進(jìn)而擾亂細(xì)胞壁的合成，促進(jìn)藥品對(duì)分枝桿菌的滲透[9]。此外，一項(xiàng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)的研究顯示，Dlm可限制MTB的有氧呼吸，提示呼吸中毒在其殺菌作用中也起著至關(guān)重要的作用[10]。

研究表明，無(wú)論臨床MTB分離株對(duì)一線抗結(jié)核藥品是否耐藥，Dlm對(duì)其在體外和體內(nèi)均顯示出較低的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC；范圍為0.006～0.024 mg/L)，具有很強(qiáng)的抗結(jié)核活性[8, 11]，可認(rèn)為Dlm對(duì)細(xì)胞內(nèi)復(fù)制活躍、低氧條件下非復(fù)制的MTB均具有較強(qiáng)的殺菌能力，且與目前使用的任何抗結(jié)核藥品均不存在交叉耐藥性[7,10]及相互作用。另有研究提出，Dlm也與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥品無(wú)相互作用[12]，且MDR-TB患者對(duì)其耐受較好，最常見的不良反應(yīng)是胃腸道反應(yīng)和失眠，提示Dlm對(duì)于并發(fā)HIV感染/AIDS和MDR-TB患者具有較好的抗菌活性。然而，Dlm用于臨床僅1年，西藏就出現(xiàn)了首例對(duì)Dlm耐藥的結(jié)核病患者，同時(shí)也對(duì)另一種抗結(jié)核新藥貝達(dá)喹啉耐藥[13-14]。因此，為有效預(yù)防Dlm耐藥的發(fā)生，應(yīng)當(dāng)深入研究其耐藥機(jī)制。

二、 Dlm的耐藥機(jī)制

1.Dlm的自發(fā)耐藥率：MTB對(duì)Dlm的耐藥性可由自發(fā)的基因突變引起。已報(bào)道的研究中，MTB標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv)對(duì)Dlm的自發(fā)耐藥頻率為6.44×10-6～4.19×10-5，卡介苗東京株為2.51×10-5～3.95×10-5，與異煙肼相似[8, 15]。另外，Kardan-Yamchi等[16]納入了35株利福平耐藥MTB菌株，發(fā)現(xiàn)9株(25.7%)對(duì)Dlm呈表型耐藥；而Wen等[17]檢測(cè)了MDR-MTB和XDR-MTB各110株菌株，發(fā)現(xiàn)僅有4株(3.6%)和3株(2.7%)對(duì)Dlm耐藥；Yang等[18]納入了420株臨床MTB分離株，發(fā)現(xiàn)41株(9.8%)對(duì)Dlm耐藥，其中15株為MDR-MTB、11株為XDR-MTB、9株為前廣泛耐藥(pre-extensively drug resistant，pre-XDR)菌株；Pang等[19]研究檢測(cè)了90株XDR-MTB臨床分離株，發(fā)現(xiàn)對(duì)Dlm的耐藥率為4.4%；Schena等[20]分析了未采用Dlm治療的結(jié)核病患者的159株臨床MTB分離株，體外耐藥性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅4株對(duì)Dlm耐藥。這些研究表明，不同來(lái)源的臨床分離菌株對(duì)于Dlm的耐藥率不盡相同，進(jìn)一步說(shuō)明對(duì)臨床分離菌株及時(shí)進(jìn)行Dlm耐藥性檢測(cè)的必要性。

2.Dlm的耐藥機(jī)制：有研究認(rèn)為，MTB獲得性耐藥與其藥物靶點(diǎn)基因或參與藥物激活基因的突變密切相關(guān)[21]。Dlm作為一種前體藥品，需要脫氮黃素依賴性硝基還原酶[deazaflavin (F420cofactor)-dependent nitroreductase，Ddn]激活其抗結(jié)核活性[15](圖1)。而Ddn的酶活性依賴于脫氮黃素F420輔因子的氧化還原循環(huán)，該循環(huán)將還原形式的F420(F420H2)氧化成F420，再由F420依賴性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(F420-dependent glucose-6-phosphate dehydrogenase，F(xiàn)gd1)將F420還原[7]，為下一個(gè)循環(huán)周期的使用做準(zhǔn)備。F420輔因子由3種F420生物合成蛋白(F420biosynthesis protein，F(xiàn)bi)——FbiA、FbiB和FbiC共同參與合成。

在實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)耐藥研究中發(fā)現(xiàn)，Dlm激活途徑中的5個(gè)基因[ddn(編碼Ddn酶)、fgd1(編碼Fgd1)、fbiA、fbiB和fbiC(分別編碼FbiA、FbiB和FbiC)]中的任一基因突變都可能導(dǎo)致對(duì)Dlm的耐藥性[15]。根據(jù)耐藥相關(guān)基因的不同，將Dlm耐藥機(jī)制分為3類：一是ddn基因突變，導(dǎo)致Ddn蛋白結(jié)構(gòu)異常、功能喪失，破壞了依賴于F420的硝基還原酶途徑；二是fbiA、fbiB和fbiC基因突變，導(dǎo)致F420合成酶的功能異常，產(chǎn)生非功能性形式的F420；三是fgd1基因突變，導(dǎo)致氧化形式F420的積累，也與Dlm耐藥性有關(guān)[15, 22]。此外，Ddn能將Dlm轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的去硝基形式代謝物[8]，而Dlm殺滅MTB的確切靶點(diǎn)尚未可知，因此推測(cè)在此硝化還原過(guò)程中產(chǎn)生的尚未鑒定的活性中間體是Dlm發(fā)揮療效的原因[7]。

圖1 參與德拉馬尼生物激活的基因

三、 Dlm耐藥基因的相關(guān)突變

據(jù)報(bào)道，Ddn、Fgd1和FbiA對(duì)MTB在體外的最佳生長(zhǎng)不是必需的，也沒(méi)有需要FbiB和FbiC必要性的證據(jù)[23]。筆者綜合了現(xiàn)有涉及Dlm耐藥基因突變結(jié)果的11篇文獻(xiàn)，對(duì)已報(bào)道的96株Dlm耐藥突變株的基因突變位點(diǎn)進(jìn)行綜述分析，發(fā)現(xiàn)ddn基因突變最常見(50株)，其次是fgd1(21株)、fbiA(11株)、fbiC(11株)基因，而fbiB基因突變最少，僅3株。

(一)ddn基因突變

已報(bào)道的對(duì)Dlm發(fā)生ddn基因突變的MTB共計(jì)62株，其中50株為耐藥菌株，12株為敏感菌株。共發(fā)現(xiàn)9個(gè)非同義突變、1個(gè)同義突變、6個(gè)移碼突變(插入/缺失突變)(表1)。

Trp88STOP**突變是攜帶有提前終止密碼子的ddn突變，與耐藥相關(guān)，且可使MTB分離株的MIC值增加1000倍(>32 mg/L)[20]，可能與其突變導(dǎo)致Ddn酶蛋白合成失敗或結(jié)構(gòu)異常，使其硝基還原功能喪失，從而對(duì)Dlm耐藥有關(guān)[24]；另外，突變頻率最多的是81位密碼子，其中Gly81Ser突變分別在耐藥株和敏感株中被發(fā)現(xiàn)，故不能確定Gly81Ser突變是否與耐藥有關(guān)[18]；而Gly81Asp、Gly53Asp、Asn91Thr、Leu107Pro突變分別在2、3、2、1株耐藥株中被發(fā)現(xiàn)，提示與耐藥相關(guān)，認(rèn)為可能與Gly53Asp和氨基酸G53位于Ddn蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，可替換其影響酶的功能有關(guān)[25]。而6個(gè)移碼突變菌株也均與耐藥相關(guān)，且MIC值除91G 缺失外均處于相對(duì)高的水平。

(二)fgd1基因突變

已報(bào)道的對(duì)Dlm發(fā)生fgd1突變的MTB共有109株，其中21株為耐藥菌株、88株為敏感菌株。共發(fā)現(xiàn)有4個(gè)非同義突變，2個(gè)同義突變，3個(gè)移碼突變(表2)。

耐藥菌株中，Ghodousi等[26]發(fā)現(xiàn)1例應(yīng)用Dlm后出現(xiàn)耐藥的患者，對(duì)其臨床分離株進(jìn)行測(cè)序后顯示為Gly104Ser突變，由此推測(cè)Gly104Ser突變可能與Dlm耐藥相關(guān)。而Ala89Pro突變、227C位點(diǎn)缺失、630G位點(diǎn)插入突變，均僅在耐藥株中被發(fā)現(xiàn)，提示與Dlm耐藥相關(guān)性較高(MIC>25 mg/L)[15]。Bloemberg等[13]發(fā)現(xiàn)1株G49移碼突變與出現(xiàn)對(duì)Dlm的表型耐藥相吻合，也可認(rèn)為與Dlm耐藥有關(guān)。但突變頻率最高的Phe320Phe同義突變，分別在10株耐藥株[15, 17]和72株敏感株[20]中被發(fā)現(xiàn)，提示與耐藥性無(wú)關(guān)。同時(shí)，Lys296Glu和Lys270Met兩個(gè)非同義突變和Tyr155Tyr同義突變分別在敏感株中被發(fā)現(xiàn)[20]，暫可認(rèn)為均與Dlm耐藥無(wú)關(guān)。

(三)fbiA基因突變

已報(bào)道對(duì)Dlm發(fā)生fbiA基因突變的MTB共計(jì)41株，其中11株為耐藥株、30株為敏感株，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)非同義突變、7個(gè)同義突變、3個(gè)移碼突變(表3)。

耐藥菌株中，提前終止密碼子突變Lys250STOP**與1株 Asp106Gly突變具有較高的MIC值，推測(cè)是導(dǎo)致Dlm耐藥的突變。Bloemberg等[13]研究發(fā)現(xiàn)3株第49位密碼子的Asp49Thr突變，且突變頻率增加，與對(duì)Dlm表型耐藥的出現(xiàn)時(shí)間相吻合；另一研究也發(fā)現(xiàn)第49位密碼子上不同的Asp49Tyr突變[14]，提示第49位密碼子突變可能與耐Dlm有關(guān)。Wen等[17]研究發(fā)現(xiàn)1株Glu249Lys非同義突變，推測(cè)可能與MTB對(duì)Dlm的高水平耐藥有關(guān)。另外，272—275CAGG插入，以及452A、222C、223C缺失僅出現(xiàn)在耐藥菌株中(MIC>25 mg/L)[15]，提示插入與缺失突變對(duì)Dlm耐藥有直接影響。而發(fā)生Arg175His突變的10株菌株中，僅1株為耐藥株[13-14]，提示Arg175His與Dlm耐藥相關(guān)性較小。

表1 Dlm耐藥相關(guān)ddn基因突變

表2 Dlm耐藥相關(guān)fgd1基因突變

表3 Dlm耐藥相關(guān)fbiA基因突變

同時(shí)，突變的敏感株包括Gln120Arg、Thr302Met、Ala37Asp、His295Tyr、Ile220Ser等非同義突變，以及249、144、113、63、181、194、267等密碼子位點(diǎn)同義突變，可見fbiA基因突變位點(diǎn)較多，但多數(shù)突變與Dlm敏感相關(guān)。

(四)fbiB基因突變

已報(bào)道對(duì)Dlm發(fā)生fbiB基因突變的MTB共計(jì)13株，其中2株為耐藥株、11株為敏感株；發(fā)現(xiàn)3個(gè)非同義突變、1個(gè)同義突變、2個(gè)移碼突變(表4)，其中1148C—1155G與1263G—1264G缺失突變僅在耐藥株中發(fā)現(xiàn)[15]，可認(rèn)為與Dlm耐藥直接相關(guān)。而敏感株中發(fā)現(xiàn)的1株Thr92Thr同義突變[25]和3株非同義突變(Leu447Arg、Lys448Arg、Phe220Leu)[20]，認(rèn)為均與Dlm耐藥無(wú)關(guān)。

(五)fbiC基因突變

已報(bào)道對(duì)Dlm發(fā)生fbiC基因突變的MTB共計(jì)23株，其中11株為耐藥株、12株為敏感株；發(fā)現(xiàn)7個(gè)為非同義突變、4個(gè)同義突變、4個(gè)缺失突變(表5)。

在耐藥菌株中，1339G、811G、813C、699C和1638T等不同位點(diǎn)的缺失突變均具有很高的MIC值[15]，可認(rèn)為與Dlm耐藥直接相關(guān)。提前終止密碼子Arg220STOP**突變的MIC>25 mg/L[15]，推測(cè)與Dlm耐藥相關(guān)。Pang等[19]研究認(rèn)為，2株Val318Ile突變是潛在的與Dlm耐藥相關(guān)的非同義突變；而Cys98Tyr和Leu53Pro非同義突變的MIC值也同樣很高[15]，認(rèn)為三者均為Dlm耐藥的相關(guān)突變。Rancoita等[24]發(fā)現(xiàn)2株Arg536Leu突變，且在同一實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ddn基因的Trp88STOP**突變比f(wàn)biC基因的Arg536Leu突變的耐藥相關(guān)性更高，說(shuō)明ddn基因?qū)lm耐藥性的產(chǎn)生更為關(guān)鍵。

表4 Dlm耐藥相關(guān)fbiB基因突變

表5 Dlm耐藥相關(guān)fbiC基因突變

Thr273Ala及Thr681Ile非同義突變和4個(gè)不同位點(diǎn)(密碼子位點(diǎn)分別為55、182、67、811)的同義突變[21]僅在敏感株中出現(xiàn)，暫認(rèn)為與Dlm耐藥無(wú)關(guān)。

四、Dlm與普托馬尼交叉耐藥突變

普托馬尼(pretomanid)，又名PA-824，與Dlm同為硝基咪唑類抗結(jié)核藥品，有著相同的耐藥機(jī)制和耐藥相關(guān)基因[27-28]。目前，僅Wen等[17]報(bào)道了1株對(duì)Dlm及PA-824同時(shí)耐藥的菌株，且均有較高的MIC值(MIC>16 mg/L)，其fbiA基因存在Glu249Lys突變，提示Glu249Lys為硝基咪唑類抗結(jié)核藥品的共同耐藥相關(guān)突變。

五、展望

對(duì)Dlm耐藥的ddn、fgd1、fbiA、fbiB、fbiC5個(gè)基因突變均存在同義、非同義突變及移碼(插入/缺失)突變，且除Phe320Phe外所有同義突變均為非耐藥相關(guān)突變，所有移碼突變均與耐藥相關(guān)；而對(duì)于僅在耐藥株中出現(xiàn)的非同義突變，可以推測(cè)與耐藥相關(guān)。建議進(jìn)一步對(duì)與耐藥相關(guān)的單氨基酸改變頻次較高的ddn、fbiA、fbiC基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可能有助于闡明突變的耐藥途徑及確定有效突變位點(diǎn)。雖然與fgd1相關(guān)耐藥突變位點(diǎn)的報(bào)道不多，但因有臨床病例證據(jù)，認(rèn)為也有必要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。而對(duì)于在各項(xiàng)研究中報(bào)道最少的fbiB突變，因未發(fā)現(xiàn)與耐藥相關(guān)的單氨基酸改變，筆者認(rèn)為研究?jī)r(jià)值相對(duì)較低。

綜上所述，筆者對(duì)Dlm耐藥基因的突變進(jìn)行了詳細(xì)分析，為進(jìn)一步研究Dlm耐藥性機(jī)制和開發(fā)新的快速的分子藥物敏感性檢測(cè)方法提供了理論參考，對(duì)指導(dǎo)臨床早期進(jìn)行分子診斷具有重要意義。