赤霉素及萌發(fā)密度對戟葉酸模種子萌發(fā)的影響*

朱璧如 李雨桐 孫 成

（北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100875）

有性繁殖是植物個體實(shí)現(xiàn)適合度最大化的重要途徑［1］。利用分子標(biāo)記鑒定親代和子代基因型，進(jìn)而通過親本分析等方法確定植物個體水平上的適合度是植物交配系統(tǒng)和性系統(tǒng)進(jìn)化研究中的重要內(nèi)容［2］。因此，獲取親代和子代基因型數(shù)據(jù)是衡量適合度的基礎(chǔ)。母本基因型一般可通過提取母本葉片或種皮基因組DNA 獲取，但子代基因型一般不能通過直接提取種子基因組DNA 獲取。

被子植物的種子可分為有胚乳和無胚乳2 種類型。對于無胚乳種子，去除由母體組織發(fā)育而來的種皮之后，可直接提取胚的基因組DNA，用于獲得子代基因型數(shù)據(jù)。但是，對于有胚乳種子，由于植物胚囊發(fā)育類型的多樣性，極核和卵細(xì)胞的基因型不一定相同，所以由受精極核發(fā)育而來的胚乳和由受精卵發(fā)育而來的胚的基因型不一定相同。因此，在沒有確定植物的胚囊發(fā)育類型前，直接利用種子檢測子代基因型時需要將胚和胚乳分離。有胚乳種子的胚一般較小，很難將其與胚乳完全分離，直接提取胚的基因組DNA 有較大的困難。種子萌發(fā)出幼苗后再提取幼苗的基因組DNA是一個可能的解決方案。然而，利用萌發(fā)的幼苗檢測子代基因型可能會受到生活史早期近交衰退（early-acting inbreeding depression）的影響［3］。例如，自交產(chǎn)生的種子萌發(fā)率可能會低于異交產(chǎn)生的種子，從而影響植物個體適合度估計(jì)，例如低估自交率。因此，利用幼苗估計(jì)子代基因型需要保證種子的高萌發(fā)率。

種子的萌發(fā)率可能受到種子休眠、個體間他感作用等因素的影響。自然休眠的種子一般可通過濕潤、低溫處理或植物生長激素打破休眠［4］。赤霉素是多種植物生長發(fā)育過程中的重要生長調(diào)節(jié)激素［5］，具有促進(jìn)種子發(fā)芽［6］、提高萌發(fā)質(zhì)量［7］等作用。此外，種子萌發(fā)過程中可能會釋放某些化學(xué)物質(zhì)，通過他感作用對周圍幼苗產(chǎn)生影響［8］。當(dāng)萌發(fā)密度較大時，鄰體幼苗周圍可能會積累更多的化感物質(zhì)，遭受更強(qiáng)烈的他感作用，萌發(fā)和幼苗生長可能會受到更強(qiáng)烈的抑制。

戟葉酸模（Rumex hastatusD.Don）是雌全異株（gynodioecious）的多年生灌木，是研究植物性系統(tǒng)進(jìn)化的理想材料。本文以戟葉酸模為研究材料，設(shè)置有、無赤霉素和高、中、低萌發(fā)密度雙因素變量，比較不同萌發(fā)條件下戟葉酸模種子萌發(fā)率、出土子葉長度、首粒種子萌發(fā)時間和半數(shù)種子萌發(fā)時間的差異，獲得戟葉酸模最優(yōu)種子萌發(fā)條件。

1 材料和方法

1.1 研究材料 戟葉酸模是蓼科酸模屬多年生風(fēng)媒傳粉灌木，植株高度一般為90～120 cm；圓錐花序，花期4—5月；瘦果卵形，具3 棱，長約2 mm，果期5—6月。在自然種群中同時存在雌性個體和兩性個體，表現(xiàn)為雌全異株的性系統(tǒng)［16］。2012年在昆明采集自然種群種子，自然干燥后置于布袋中常溫保存。

1.2 種子萌發(fā) 選取約10 000 粒種子，平均分成2 份。將2 份種子分別浸泡在無菌水中，置于4℃冰箱進(jìn)行低溫處理，每24 h 更換一次無菌水，連續(xù)處理3 d。第4 天，將其中一份使用1×10-4mol／L 的赤霉素溶液4℃低溫處理，另一份繼續(xù)使用滅菌水4℃低溫處理；之后繼續(xù)使用滅菌水對2 份種子進(jìn)行4℃低溫處理，每24 h 更換一次無菌水，連續(xù)處理3 d。將前述處理的種子置于墊有2 層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，擺放密度分別為16 粒／皿（0.063 個／cm2）、32 粒/皿（0.126 個／cm2）、48 粒／皿（0.189 個／cm2）。3 種密度水平和有、無赤霉素組合成6 種處理，每種處理設(shè)置30 個重復(fù)，置于溫室中進(jìn)行萌發(fā)，溫室白天溫度為20～35℃，濕度為20%～40%。保持培養(yǎng)皿中濾紙濕潤。每天對培養(yǎng)皿的擺放位置進(jìn)行隨機(jī)化處理，并記錄萌發(fā)種子數(shù)，測量萌發(fā)5 d 后的出土子葉長度。將第15 天的萌發(fā)率作為最終萌發(fā)率用于數(shù)據(jù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析 用R 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將每一個培養(yǎng)皿作為一個觀察樣本，樣本大小為180。因?yàn)槊劝l(fā)率是比例數(shù)據(jù)，因此使用廣義線性模型（generalized linear models）分析萌發(fā)密度和赤霉素處理對種子萌發(fā)率的影響，模型中解釋變量為萌發(fā)密度和赤霉素，同時考慮二者的交互作用，使用R 軟件中的glm（）命令。用雙因素方差分析（twoway ANOVA）分析萌發(fā)密度和赤霉素處理對出土子葉長度的影響，將萌發(fā)密度和赤霉素作為解釋變量，同時考慮二者的交互作用。為了檢驗(yàn)萌發(fā)密度和赤霉素處理是否會影響種子萌發(fā)的時間，將同一種處理的30 個培養(yǎng)皿作為一個觀察樣本，通過記錄每天每個培養(yǎng)皿中種子萌發(fā)的數(shù)量，計(jì)算每天每種處理中第1 粒種子萌發(fā)的培養(yǎng)皿個數(shù)（首粒種子萌發(fā)皿數(shù)），以及有50%種子萌發(fā)的培養(yǎng)皿的個數(shù)（半數(shù)種子萌發(fā)皿數(shù)）。這2 個指標(biāo)均為隨時間重復(fù)測量的計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，且相同處理中不同培養(yǎng)皿的種子萌發(fā)可能存在差異，因此采用廣義線性混合模型（generalized linear mixed-effect models）分析萌發(fā)密度和赤霉素對這2 個指標(biāo)的影響，萌發(fā)密度和赤霉素處理作為固定因子，時間和培養(yǎng)皿編號作為隨機(jī)因子，使用R 軟件lme4 軟件包中的glemr（）命令。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 赤霉素及萌發(fā)密度對種子萌發(fā)率的影響 無赤霉素處理時，低、中、高3 種密度下戟葉酸模種子的萌發(fā)率分別為（54.17±3.85）%、（62.19±3.53）%、（55.90±2.85）%（均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=30）；有赤霉素處理時，低、中、高3 種密度下種子的萌發(fā)率分別為（54.79±4.11）%、（59.48±2.42）%、（61.46±1.96）%（圖1）。廣義線性模型分析的結(jié)果表明赤霉素（t=-0.245，P=0.807）和萌發(fā)密度（t=-0.819，P=0.414）對戟葉酸模種子的萌發(fā)率均沒有顯著的影響，且二者之間也不存在交互作用（t＝1.122，P＝0.263）。

圖1 不同萌發(fā)密度和赤霉素處理下戟葉酸模種子的萌發(fā)率

2.2 赤霉素及萌發(fā)密度對出土子葉長度的影響 無赤霉素處理時，低、中、高3 種密度下出土子葉的長度分別為（5.52±0.056）mm、（5.44±0.034）mm、（5.39±0.041）mm（n=30）;赤霉素處理時，低、中、高3 種密度下出土子葉長度分別為（5.86±0.072）mm、（5.86±0.050）mm、（5.95±0.044）mm（圖2）。雙因素方差分析的結(jié)果表明萌發(fā)密度對出土子葉長度沒有顯著的影響（F=0.402，df=2，P=0.669），但是赤霉素對出土子葉長度有顯著影響（F=109.2，df=1，P＜0.001），赤霉素處理顯著提高了出土子葉長度，萌發(fā)密度和赤霉素之間沒有交互作用（F=2.62，df=2，P=0.076）。

圖2 不同萌發(fā)密度和赤霉素處理下戟葉酸模種子的出土子葉長度

2.3 赤霉素及萌發(fā)密度對種子萌發(fā)時間的影響 萌發(fā)處理后的第3 天，即4月1日，開始有第1 粒種子萌發(fā)，各處理組的第1 粒種子萌發(fā)的時間主要集中在4月2日（圖3）。廣義線性混合模型分析的結(jié)果表明萌發(fā)密度（z=-0.362，P=0.717）和赤霉素處理（z=-1.025，P=0.305）對首粒種子萌發(fā)皿數(shù)均沒有顯著影響。說明赤霉素和萌發(fā)密度對每個培養(yǎng)皿中第1 粒種子萌發(fā)的時間均沒有顯著的影響。

圖3 不同萌發(fā)密度和赤霉素處理下首粒種子萌發(fā)皿數(shù)隨時間的變化

萌發(fā)處理后的第6 天，即4月3日，開始出現(xiàn)萌發(fā)種子數(shù)超過50%的培養(yǎng)皿，從3日至9日不同處理組中萌發(fā)種子數(shù)量超過50 %的培養(yǎng)皿數(shù)增加較快，之后增加較為平緩（圖4）。廣義線性混合模型分析的結(jié)果表明，萌發(fā)密度對半數(shù)種子萌發(fā)皿數(shù)沒有顯著影響（z=1.604，P=0.109），但赤霉素對半數(shù)種子萌發(fā)皿數(shù)有顯著影響（z=-4.025，P＜0.001），赤霉素處理顯著推遲了每個培養(yǎng)皿中種子萌發(fā)數(shù)量超過50%的時間。

圖4 不同萌發(fā)密度和赤霉素處理下半數(shù)種子萌發(fā)皿數(shù)隨時間的變化

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，萌發(fā)密度對戟葉酸模種子萌發(fā)的4 個指標(biāo)均沒有顯著的影響；赤霉素處理對萌發(fā)率和首粒種子萌發(fā)時間沒有顯著的影響，但經(jīng)過赤霉素處理后，出土子葉長度顯著增加，半數(shù)種子萌發(fā)時間顯著推遲（圖1～圖4）。

在波動的自然環(huán)境中，植物種子可通過休眠降低所有種子同時萌發(fā)帶來的潛在危險，同時植物種子還可通過捕捉特定信號改變萌發(fā)時間［9］，以便在出現(xiàn)適宜環(huán)境的時候進(jìn)行萌發(fā)，提高存活率。種子密度［10］、赤霉素［5］等都會影響種子的萌發(fā)。一般認(rèn)為種子密度增加會抑制種子的萌發(fā)，因?yàn)榇藭r種子可能通過化感物質(zhì)識別到種內(nèi)競爭加劇而選擇休眠。Murray［9］研究了萌發(fā)密度對12 種植物種子萌發(fā)率的影響，發(fā)現(xiàn)11 種植物的種子在高密度（0.22 個／cm2）情況下的萌發(fā)率顯著小于低密度（0.022 個／cm2）情況下的萌發(fā)率。但也有研究發(fā)現(xiàn)，水車前（Ottelia alismoides）種子的萌發(fā)率隨著萌發(fā)密度（0.177～1.77 個／cm2）的增加而增大，二者呈顯著的線性正相關(guān)關(guān)系［10］。本研究的結(jié)果顯示，萌發(fā)密度的增加對戟葉酸模種子的萌發(fā)率沒有顯著影響（圖1）。戟葉酸模耐貧瘠，耐干旱，常作為石灰?guī)r地區(qū)的先鋒植物出現(xiàn)［11］，對生長環(huán)境和資源要求不高；此外，戟葉酸模種子較小，單個長度在2 mm 左右。因此，本研究中設(shè)置的高密度（0.189 個／cm2）對戟葉酸模種子來說可能尚未達(dá)到加劇種內(nèi)競爭的程度。

種子萌發(fā)也受激素的調(diào)節(jié)，主要是受脫落酸及赤霉素的影響。脫落酸是引起種子休眠和維持種子休眠的正調(diào)節(jié)物，而赤霉素會促使合成或激活細(xì)胞壁松弛酶，誘導(dǎo)胚根突出從而促進(jìn)種子萌發(fā)，所以赤霉素的存在可中和脫落酸的抑制作用［12-13］。但赤霉素并非對所有種子的萌發(fā)都有促進(jìn)作用。有研究發(fā)現(xiàn)多種赤霉素濃度（0～2.29×10-3mol／L）都對巴天酸模（R.patientia）種子的萌發(fā)具有抑制作用［14］。在對小酸模（R.acetosella）種子的萌發(fā)進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，隨赤霉素的濃度從低到高變化（0～0.9×10-3mol／L），萌發(fā)率先上升后下降［15］。本研究中，赤霉素處理沒有顯著提高種子的萌發(fā)率，可能是因?yàn)?×10-4mol／L 的赤霉素增量并沒有顯著提高種子內(nèi)赤霉素的濃度，因此，有、無赤霉素處理組之間的差異并不顯著（圖1）。

有許多研究指出，子葉的面積減小會影響小苗和周圍植被之間的相互作用，同時會減少幼苗的生物量甚至降低幼苗的存活率［16］。在營養(yǎng)缺乏的區(qū)域，子葉的大小對小苗初期的建立意義重大［17］。赤霉素能顯著提高種子萌發(fā)質(zhì)量，因?yàn)槌嗝顾乜烧T導(dǎo)一系列與水解酶有關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)水解酶特別是α-淀粉酶的合成，使胚乳中的營養(yǎng)轉(zhuǎn)化為可溶解狀態(tài)供胚的萌發(fā)使用［18］，促進(jìn)根的伸長、增加葉面積等［5，19］，從而在對陽光和水分的競爭中表現(xiàn)出優(yōu)勢［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，1×10-4mol／L 的赤霉素可顯著提高萌發(fā)種子的出土子葉長度（圖2），不僅有利于植株的建立，更可在隨后的親本分析中提供更多的分子材料，這為植物親子鑒定研究提供了便利。

赤霉素還可能加快種子的萌發(fā)，例如在對金剛鸚鵡棕櫚籽（Macaw palm）的萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中，添加赤霉素不僅讓種子萌發(fā)的比例增加，而且加快了種子萌發(fā)的速度［12］。本實(shí)驗(yàn)中，赤霉素對種子整體的初始萌發(fā)日期沒有顯著影響，但顯著延遲了種子整體的半數(shù)萌發(fā)時間（圖3、圖4），這說明赤霉素的存在減緩了種子前期萌發(fā)速率。這可能是由于萌發(fā)速度和萌發(fā)質(zhì)量之間存在著權(quán)衡（tradeoff），即更好的萌發(fā)質(zhì)量可能需要更長時間的萌發(fā)前準(zhǔn)備，例如本實(shí)驗(yàn)中赤霉素的添加雖然減緩了種子萌發(fā)速度，但增加了出土子葉長度，提高了萌發(fā)質(zhì)量。