紫蘇葉多酚超聲輔助聚乙二醇提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

茹巧美 任國平 胡 瓊

(杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院康養(yǎng)旅游系，浙江 杭州 310023)

紫蘇[Perillafrutescens(L.) Britt]系唇形科一年生草本植物，廣泛分布于東南亞國家，是中國衛(wèi)生部頒布的第一批藥食同源植物[1]。紫蘇葉具有抗過敏、抗炎、抗氧化、抗癌、抗菌、抗抑郁、止咳作用，主要?dú)w因于其高含量生物活性物質(zhì)，特別是酚類、黃酮、三萜類、揮發(fā)性化合物等[2]。

常見的多酚提取方法主要有超臨界流體萃取[3]、加壓液相萃取[4]、酶解法[5]和溶劑浸提法[6]等。溶劑浸提多酚是一種較為傳統(tǒng)的操作，其中乙醇、丙酮、甲醇、異丙醇等是提取多酚的主要有機(jī)溶劑[7]。近年來，亞臨界水[8]、β-環(huán)糊精[9]、深度共晶溶劑—甘油水溶液[10]等多酚綠色提取劑已被開發(fā)。聚乙二醇是一種非揮發(fā)性且具有一定穩(wěn)定性的有機(jī)溶劑，與水有良好的混溶性且成本低，是一種環(huán)境友好型溶劑，被廣泛應(yīng)用于雙水相萃取以及濁點(diǎn)萃取等提取試驗(yàn)[11]。試驗(yàn)擬以紫蘇葉為原料，采用超聲輔助聚乙二醇提取紫蘇葉多酚并研究其抗氧化活性，旨在為紫蘇葉多酚的綠色提取及工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

紫蘇葉：紅葉紫蘇，產(chǎn)地浙江湖州；

聚乙二醇-200(平均分子量為200的聚乙二醇)、沒食子酸(GAE)：分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超聲波清洗器：KH5200DB型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子天平：BSA224S型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

臺式高速冷凍離心機(jī)：TGL-16M型，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R502B型，上海申生科技有限公司；

紫外—可見分光光度計：UV-5800PC型，上海元析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將新鮮無蟲害紫蘇葉洗凈，自然風(fēng)干后磨粉過200目篩，裝袋密封后于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 紫蘇葉多酚提取工藝 取適量紫蘇葉粉，與聚乙二醇混合均勻，在不同條件下進(jìn)行超聲波輔助(超聲頻率40 kHz)提取，迅速冷卻至室溫，11 000 r/min離心20 min，收集上清液，測定多酚含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

(1) 聚乙二醇濃度：固定液料比(V聚乙二醇∶m紫蘇葉)30∶1 (mL/g)，超聲功率140 W，超聲時間40 min，考察聚乙二醇濃度(50%，60%，70%，80%，90%)對多酚提取率的影響。

(2) 液料比：固定聚乙二醇濃度70%，超聲功率140 W，超聲時間40 min，考察液料比[V聚乙二醇∶m紫蘇葉為10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)]對多酚提取率的影響。

(3) 超聲功率：固定聚乙二醇濃度70%，液料比(V聚乙二醇∶m紫蘇葉)30∶1 (mL/g)，超聲時間40 min，考察超聲功率(100，120，140，160，180，200 W)對多酚提取率的影響。

(4) 超聲時間：固定聚乙二醇濃度70%，液料比(V聚乙二醇∶m紫蘇葉)30∶1 (mL/g)，超聲功率140 W，考察提取時間(20，30，40，50，60 min)對多酚提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken中心原理，以聚乙二醇濃度、液料比、超聲功率和超聲時間為自變量，多酚提取率為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.2.5 多酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu法[12]。

1.2.6 抗氧化活性測定

(1) ·OH清除率：參照Shen等[13]的方法稍作改動。分別取1.0 mL水楊酸(6 mmol/L)、0.5 mL FeSO4(17.5 mmol/L)于比色管中，加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度的紫蘇葉多酚溶液，再加入0.5 mL H2O2(8.8 mmol/L)啟動反應(yīng)，37 ℃水浴30 min，測定532 nm處吸光度，以70%聚乙二醇代替樣品溶液為空白組，以去離子水代替H2O2為對照組，按式(1)計算·OH清除率。

(1)

式中：

E——自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度；

A1——樣品組吸光度；

A2——對照組吸光度。

(3) DPPH·清除率：參照Pandey等[15]的方法略作改動。取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的紫蘇葉多酚溶液，加入3.0 mL DPPH(0.2 mmol/L)溶液搖勻，避光室溫保存30 min，測定517 nm處吸光度，以70%聚乙二醇溶液作空白，按式(1)計算DPPH·清除率。

(4) 還原力：參照Rozi等[16]的方法略修改。取1 mL不同質(zhì)量濃度的紫蘇葉多酚溶液，加入2.5 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)，2.5 mL鐵氰化鉀(1.0%)，混勻，50 ℃水浴20 min，以2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)。3 000 r/min 離心10 min，取上清液5 mL，加入4 mL去離子水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，室溫放置10 min，測定700 nm處吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)平行3次，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計與統(tǒng)計分析；采用SPSS 22.0、Origin 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 聚乙二醇濃度對紫蘇葉多酚提取率的影響 由圖1 可知，多酚提取率隨聚乙二醇濃度的增加先增大后降低，當(dāng)聚乙二醇濃度為60%時多酚提取率最大，為17.92 mg GAE/g·DW。這可能是有一部分植物多酚以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形式存在，有機(jī)溶劑濃度過高會使蛋白質(zhì)變性，不利于此部分多酚溶出[17]。因此，確定聚乙二醇濃度為60%。

2.1.2 液料比對紫蘇葉多酚提取率的影響 由圖2可知，多酚提取率隨液料比的增加先顯著增加后略有下降，當(dāng)液料比(V聚乙二醇∶m紫蘇葉)為40∶1 (mL/g)時多酚提取率最高，為17.55 mg GAE/g·DW。這主要是因?yàn)樵黾右毫媳?，固液兩相的接觸面積增加，同時溶質(zhì)與溶劑之間的濃度差增大，有利于多酚物質(zhì)由原料向溶劑擴(kuò)散，聚乙二醇中溶解的多酚也不斷增多；而過多的提取劑導(dǎo)致其他雜質(zhì)成分如半纖維素、葉綠素等的溶出量增多，影響多酚物質(zhì)的提取，同時增加熱負(fù)荷以及提取時間，回收溶劑成本也有所增高[18]。綜合考慮，液料比(V聚乙二醇∶m紫蘇葉)固定為40∶1 (mL/g)。

圖1 聚乙二醇濃度對紫蘇葉多酚提取率的影響

圖2 液料比對紫蘇葉多酚提取率的影響

2.1.3 超聲功率對紫蘇葉多酚提取率的影響 由圖3可知，多酚提取率隨超聲功率的增大先增大后明顯下降，當(dāng)超聲功率為140 W時達(dá)最大值(17.16 mg CGE/g·DW)。這是由于超聲波引起的空化效應(yīng)隨超聲功率的增大而增強(qiáng)，同時提取液溫度不斷上升，溶液擴(kuò)散速度加快，紫蘇葉粉末顆粒膨脹，促使酚類物質(zhì)滲透速率加快，聚乙二醇對多酚的溶解度逐漸增加，但超聲功率過高，熱效應(yīng)顯著，會導(dǎo)致酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，部分多酚分解，提取率下降[19]。因此超聲功率宜選擇140 W。

2.1.4 超聲時間對紫蘇葉多酚提取率的影響 由圖4可知，多酚提取率隨超聲時間的增加先增大后減少，當(dāng)超聲時間為60 min時提取率最高，達(dá)17.68 mg GAE/g·DW。Kazemi等[20]表明，超聲輔助提取過程中，較長的超聲時間有助于細(xì)胞壁的進(jìn)一步破壞和酚類物質(zhì)的滲透，提取率增加。而超聲時間過長，多酚會氧化為醌類物質(zhì)或者分解，不利于多酚提取[21]。因此，最佳超聲時間為60 min。

圖3 超聲功率對紫蘇葉多酚提取率的影響

圖4 超聲時間對紫蘇葉多酚提取率的影響

2.2 紫蘇葉多酚提取工藝參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以聚乙二醇濃度、液料比、超聲功率和超聲時間為自變量，以多酚提取率為響應(yīng)值進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，因素水平表見表1，試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析 通過Design Expert 8.0.6軟件對表2進(jìn)行多元回歸擬合，得二次多項(xiàng)回歸方程為：

(2)

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

2.2.3 兩因素間交互作用 由圖5可知，多酚提取率隨聚乙二醇濃度、液料比、超聲功率和超聲時間的增加呈先增大后減小的趨勢。其中，聚乙二醇濃度和超聲功率對響應(yīng)值的影響大，表現(xiàn)曲面較陡，聚二乙醇濃度對多酚提取率的曲線更陡峭，說明聚乙二醇濃度影響更大；而液料比和超聲時間的曲面相對較平緩，說明對多酚提取率影響較小。聚乙二醇濃度與超聲功率的交互作用顯著，但其余各因素間的交互作用不顯著，與表3結(jié)果相符，說明該模型可以較好地描述聚乙二醇濃度、液料比、超聲功率和超聲時間4個因素對紫蘇葉多酚提取率的影響。

表3 回歸模型方差分析?

2.2.4 最佳工藝條件預(yù)測與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由Design Expert 8.0.6軟件預(yù)測紫蘇葉多酚的最佳提取條件為：聚乙二醇濃度68.31%、液料比(V聚乙二醇∶m紫蘇葉)46.00∶1 (mL/g)、超聲功率157.18 W、超聲時間67.45 min。考慮實(shí)際條件的可操作性，將最佳提取工藝調(diào)整為：聚乙二醇濃度68%、液料比(V聚乙二醇∶m紫蘇葉)46∶1 (mL/g)、超聲功率157 ℃、超聲時間67 min。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得紫蘇葉多酚提取率為18.21 mg GAE/g·DW，與預(yù)測值18.38 mg GAE/g·DW接近，說明該模型對紫蘇葉多酚提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠，具有較好的應(yīng)用價值。此外，聚乙二醇—超聲輔助提取的紫蘇葉多酚得率略高于乙醇—微波輔助提取的(15.744 mg/g·DW)[22]。

圖5 各因素交互作用對紫蘇葉多酚提取率的影響

2.3 紫蘇葉多酚的抗氧化活性

2.3.1 ·OH清除能力 由圖6可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為10～100 μg/mL時，紫蘇葉多酚對·OH有明顯的清除能力，且清除活性隨多酚質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度≤20 μg/mL時，紫蘇葉多酚和維生素C對·OH的清除率沒有顯著差異；當(dāng)質(zhì)量濃度≥40 μg/mL時，紫蘇葉多酚對·OH的清除率低于同質(zhì)量濃度維生素C。紫蘇葉多酚對·OH的最大清除率為81.69%，低于維生素C的(96.21%)，且紫蘇葉多酚和維生素C對·OH清除率的IC50分別為62.62，50.84 μg/mL，說明紫蘇葉多酚具有較好的·OH清除能力。

圖6 紫蘇葉多酚對·OH的清除能力

圖7 紫蘇葉多酚對的清除能力

2.3.3 DPPH·清除能力 由圖8可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為10～100 μg/mL時，紫蘇葉多酚對DPPH·的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增加；當(dāng)質(zhì)量濃度≤40 μg/mL時，紫蘇葉多酚和維生素C對DPPH·的清除率沒有顯著差異；當(dāng)質(zhì)量濃度≥60 μg/mL時，紫蘇葉多酚對DPPH·的清除率低于同質(zhì)量濃度維生素C；當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，紫蘇葉多酚和維生素C對DPPH·的清除率分別為82.26%，98.87%，IC50分別為53.44，49.51 μg/mL，表明紫蘇葉多酚具有較強(qiáng)的DPPH·清除能力。

2.3.4 還原能力 由圖9可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為10～100 μg/mL 時，多酚對鐵離子的還原力隨質(zhì)量濃度的增大呈上升趨勢；當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，紫蘇葉多酚還原力為維生素C的72.53%。紫蘇葉多酚和維生素C對還原力的IC50分別為32.57，13.71 μg/mL，表明紫蘇葉多酚具有較好的還原力。

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，超聲輔助聚乙二醇提取紫蘇葉多酚的最佳工藝為聚乙二醇濃度68%、液料比(V聚乙二醇∶m紫蘇葉)46∶1 (mL/g)、超聲功率157 W、超聲時間67 min，此條件下多酚提取率為18.21 mg GAE/g·DW?？寡趸囼?yàn)表明，紫蘇葉多酚具有較好的抗氧化性能，量效關(guān)系明顯，說明紫蘇葉多酚可開發(fā)為食品、化妝品、藥品等行業(yè)的天然抗氧化物。后續(xù)需利用大孔吸附樹脂和色譜等方法進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及活性評價。

圖8 紫蘇葉多酚對DPPH·的清除能力

圖9 紫蘇葉多酚的還原能力