卵型家族蛋白轉(zhuǎn)錄因子AtOFP8的抗旱性功能分析

劉守銀，唐 堯，韓佳良，常 纓

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

卵型家族蛋白(Ovate family proteins, OFPs)是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族[1]，參與調(diào)控植物的生長和發(fā)育的多個方面，該蛋白家族的特征是具有保守的OVATE結(jié)構(gòu)域，在OVATE蛋白質(zhì)的羧基末端包含一個由70個氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)域，OVATE基因首先在番茄中被鑒定為果實形狀的關(guān)鍵調(diào)控因子[2]。該蛋白質(zhì)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、番茄(Solanumlycopersicum)[1]和水稻(Oryzasativa)[4]中均是保守的。在擬南芥卵形家族蛋白(AtOFPs)具有多種生物學(xué)功能，如AtOFP1作為一種轉(zhuǎn)錄阻遏物，可通過控制赤霉素生物合成酶AtGA20ox1的表達來調(diào)節(jié)細胞的伸長[5]；AtOFP4與KNAT7的相互作用可以調(diào)節(jié)擬南芥中次生細胞壁的形成[6]；AtOFP15和AtOFP16參與調(diào)控擬南芥莢果的形態(tài)發(fā)育[7]。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院常纓教授課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，Columbia野生型擬南芥(Col)的表皮蠟質(zhì)分布比Atofp8-1突變體更多，并且低于35S∶HA-AtOFP8的植株，說明AtOFP8能夠增加擬南芥表皮蠟質(zhì)的積累[8]，植物表皮蠟質(zhì)具有限制水分蒸騰的作用，進而保護植物體內(nèi)水分散失[9]。在干旱條件處理擬南芥發(fā)現(xiàn)，AtOFP8的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升，推測AtOFP8可能參與抵抗干旱脅迫的生物過程[10-11]。

有研究報道，水稻OsOFP6的過表達會引起失水速度和H2O2積累降低，而RNAi植物的失水速度和H2O2含量積累更快，表明OsOFP6可以提高水稻的抗旱性[12]。因此，本研究以AtOFP8作為研究對象，從擬南芥種子萌發(fā)率及幼苗生長、質(zhì)膜穩(wěn)定性、抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)能力及干旱應(yīng)答基因表達水平的角度，探索轉(zhuǎn)錄因子AtOFP8在擬南芥應(yīng)對干旱脅迫中的作用，以期為利用該基因提高擬南芥的抗旱性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗應(yīng)用Columbia野生型(Col)、Atofp8-1突變體和35S∶HA-AtOFP8擬南芥為試驗材料，試驗材料由東北師范大學(xué)王樹才教授提供。擬南芥的生長培養(yǎng)條件：溫度23 ℃，光周期為16 h/8 h(光照/黑暗)。

1.2 試驗方法

1.2.1 AtOFP8基因突變體及過表達體的鑒定 根據(jù)已知的AtOFP8基因(At5g19650)設(shè)計引物，AtOFP8基因的正向引物和反向引物分別為5′-TT CTTTGCTCATACGGTCA-3′和5′-GGAGAGAACAAG GTGGCATAAA-3′, 以擬南芥中ACTIN2為內(nèi)參基因，正向引物和反向引物分別為5′-CTCGTTGTCCT CCTCACTT-3′和5′-TTCTTTGCTCATACGGTCA-3′，應(yīng)用PCR技術(shù)對Atofp8-1突變體和35S∶HA-AtOFP8植株進行鑒定。

1.2.2 干旱脅迫下擬南芥植株表型觀察及生理指標(biāo)分析 將Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8擬南芥種子分別種在甘露醇濃度為0，200，300 mmol/L的1/2 MS培養(yǎng)基中，每個平板中播50粒擬南芥種子，觀察分析種子的萌發(fā)狀況及子葉變綠狀況，以胚根突破種皮 1 mm即視為萌發(fā)，子葉完全變綠才計為綠葉。

擬南芥植株培養(yǎng)21 d時，對照組生長環(huán)境不變，干旱試驗的植株停止?jié)菜?，拍照記錄植株變化。分別在干旱試驗開始后的第5，10，15天取對照組和試驗組植株的葉片，液氮速凍用于測定生理指標(biāo)。丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[13]；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法測定[14]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[15]；脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮比色法測定[16]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法[17]。

1.2.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)試驗 實時熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)為Mx-3000p Real-time PCR Systerm。根據(jù)AtADH1基因(AT1G77120)設(shè)計的正向引物和反向引物分別為5′-TGTGACCGAGTGTGTGAACCC-3′和5′-GATGAGTCTTGAAGGCATCGTCT-3′，AtRD26基因(AT4G27410)的正向引物和反向引物分別為5′-TGG AAAGCAACGGGTACTGAC-3′和5′-TCCAGATGTTTT CTTGTAAATTCGAC-3′，AtRDUF2基因(AT5G59550)的正向引物和反向引物分別為5′-GATTCGCCGTA GGGAGGTTTA-3′和5′-GAACCTGAGCCAGTACCGT TAC-3′，AtERD7基因(AT2G17840)的正向引物和反向引物分別為5′-AAGCGAAGGAAGCAGGTGAAA-3′和5′-TCCCCAAATAAGCCTATCCATAGTC-3′，AtOFP8基因(At5g19650)的正向引物和反向引物分別為5′-CCCACCAAACCCTTTCTACGA-3′和5′-GGGTCAGAA CCAAACTGCGAT-3′，以擬南芥中ACTIN2為內(nèi)參基因，正向引物和反向引物分別為5′-TGGGTTTTTACT TACGTCTGCG-3′和5′-GGGAACAAAAGGAATAAAGA GGC-3′。取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，用軟件SPSS分析對照組與試驗組的數(shù)據(jù)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtOFP8基因突變體及過表達植株的鑒定

如圖1所示，與Col植株相比，35S∶HA-AtOFP8過表達擬南芥中植株AtOFP8基因的轉(zhuǎn)錄水平增加，Atofp8-1突變體植株中未檢測到AtOFP8基因的轉(zhuǎn)錄。

2.2 AtOFP8對干旱擬南芥種子萌發(fā)率及幼苗生長的影響

2.2.1 種子萌發(fā)率 在對照組中，Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株種子萌發(fā)率無顯著差異，且在第4天時，萌發(fā)率為100%(圖2-A)；在200 mmol/L甘露醇處理5 d時，35S∶HA-AtOFP8和Col植株種子萌發(fā)率為100%，Atofp8-1植株種子萌發(fā)率為88%，在7 d時，Atofp8-1植株萌發(fā)率為100%(圖2-B)；在300 mmol/L甘露醇處理7 d時，Col 和35S∶HA-AtOFP8植株種子萌發(fā)率為100%，而Atofp8-1植株種子萌發(fā)率僅為76%(圖2-C)，表明干旱脅迫嚴(yán)重抑制了Atofp8-1植株種子萌發(fā)率。

圖1 Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株的鑒定Fig.1 Molecular identification of the Atofp8-1 mutant and 35S∶HA-AtOFP8 transgenic plants

A.對照組；B.200 mmol/L甘露醇試驗組； C.300 mmol/L甘露醇試驗組。圖3同。 A.Control group; B.200 mmol/L mannitol experimental group; C.300 mmol/L mannitol experimental group.The same as Fig.3.

2.2.2 綠葉率 植物葉片對干旱脅迫十分敏感，輕度干旱脅迫就會使植株葉片發(fā)生性狀變化。在對照組中，Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株綠葉率無顯著差異，且在7 d時綠葉率均為100%(圖3-A)；在200 mmol/L甘露醇處理9 d時，35S∶HA-AtOFP8和Col植株綠葉率均為100%，Atofp8-1植株綠葉率為84%(圖3-B)；在300 mmol/L甘露醇處理11 d時，35S∶HA-AtOFP8植株綠葉率為54%，Col植株綠葉率為24%，但Atofp8-1植株綠葉率只有12%(圖3-C)。

圖3 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8 植株在不同濃度甘露醇處理下的綠葉率Fig.3 Green leaf rate of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant treated with different concentrations of mannitol

2.2.3 表型 當(dāng)植物遭受干旱脅迫時，葉片會出現(xiàn)下垂的表型，抗旱性較強的植株，葉片下垂程度較輕，葉片中相對含水量更高。對Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株同時停止?jié)菜?8 d，觀察植株在干旱脅迫下的變化(圖4)，3種擬南芥植株的表型差異十分明顯，其中，Atofp8-1植株葉片萎蔫十分嚴(yán)重，而且部分植株干枯，葉片發(fā)黃細??；Col植株葉片也出現(xiàn)萎蔫的性狀，多數(shù)葉片發(fā)生卷曲，但少量葉片黃化；35S∶HA-AtOFP8植株葉片只有輕度萎蔫，少數(shù)葉片發(fā)生卷曲，葉片黃化程度低于Col植株。說明35S∶HA-AtOFP8植株的抗干旱能力最強。

圖4 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株在干旱脅迫下生長情況Fig.4 Growth of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant under drought stress

2.3 AtOFP8對干旱脅迫下植株MDA含量的影響

植物在受到干旱脅迫時，植株體內(nèi)的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)含量會上升，使細胞脂膜受到過氧化作用而形成MDA，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，因此，經(jīng)常用MDA的含量代表脂膜的過氧化程度[18]。如圖5所示，干旱處理5 d時，與對照組相比，Atofp8-1植株葉片中MDA的含量(以鮮質(zhì)量計)顯著增加了60.3%，而Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中的MDA含量與對照組中的MDA含量無顯著差異，說明此時干旱脅迫還未對Col和35S∶HA-AtOFP8植株的細胞脂膜造成過氧化傷害。干旱處理10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中MDA的含量分別較對照顯著升高了103.4%，67.8%和36.9%，說明此時干旱脅迫對植株細胞膜脂產(chǎn)生過氧化傷害，與Col植株相比，Atofp8-1植株的細胞膜受損更嚴(yán)重，35S∶HA-AtOFP8植株受損最小，但Col、Atofp8-1、35S∶HA-AtOFP8之間差異均未達顯著水平。干旱脅迫15 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中MDA的含量分別較對照顯著升高了229.8%，130.4%和71.1%，且35S∶HA-AtOFP8與Col和Atofp8-1差異顯著，表明過表達AtOFP8基因能夠減輕干旱脅迫對擬南芥植株造成的過氧化損傷。

相同字母表示不具有顯著差異(P>0.05);不同字母表示具有顯著差異(P<0.05)。圖6-10同。 The same letters indicate no significant difference(P>0.05)；Different letters indicate significant difference(P<0.05).The same as Fig.6-10.

2.4 AtOFP8對干旱脅迫下植株抗氧化酶活性的影響

2.4.1 SOD活性 植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，能夠保護植物細胞脂膜免受過氧化作用的傷害，植物體中的抗氧化酶包括SOD和POD。SOD 是植物細胞中廣泛分布的一類金屬酶,它組成了植物細胞內(nèi)第一條抗氧化系統(tǒng)的防線, 在干旱脅迫下植物細胞內(nèi)SOD 活性與其抗氧化能力呈正相關(guān)[19]。如圖6所示，干旱脅迫5 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中SOD的含量(以鮮質(zhì)量計)分別較對照升高了10.9%，21.4%和27.6%；干旱脅迫10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中SOD的含量分別較對照升高了19.6%，62.5%和76.4%；干旱脅迫15 d時，Atofp8-1突變體、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中SOD的含量分別較對照升高了16.3%，47.0%和67.3%。

圖6 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株在干旱脅迫下的SOD活性Fig.6 SOD activity of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant under drought stress

2.4.2 POD活性 POD在植物正常生長和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，是植物體內(nèi)重要的保護酶類。如圖7所示，干旱脅迫5 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中POD的含量(以鮮質(zhì)量計)分別較對照升高了18.5%，32.5%和38.3%; 干旱處理10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中POD的含量分別較對照升高了48.5%，79.5%和181.1%; 干旱處理15 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中POD的含量分別較對照升高了30.1%，44.0%和86.2%。

圖7 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株在干旱脅迫下的POD活性Fig.7 POD activity of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant under drought stress

2.5 AtOFP8對干旱脅迫下植株滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.5.1 脯氨酸含量 滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)干旱脅迫的重要生理機制，干旱脅迫會引起植物脫水造成滲透脅迫，植物通過大量合成和積累滲透保護劑來緩解干旱脅迫，降低水分的流失，大量研究表明，可溶性蛋白和脯氨酸是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[20]。如圖8所示，在對照組中，Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中脯氨酸含量(以鮮質(zhì)量計)無顯著差異；干旱處理10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中脯氨酸的含量分別較對照升高40.0%，87.8%和242.6%，且35S∶HA-AtOFP8與Col和Atofp8-1差異顯著，表明AtOFP8能增加干旱脅迫下的擬南芥葉片中游離脯氨酸的積累，降低水分的流失。

2.5.2 可溶性蛋白含量 如圖9所示，干旱處理10 d時，Atofp8-1、Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中可溶性蛋白的含量(以鮮質(zhì)量計)分別較對照升高了29.6%，40.1%和67.4%，且35S∶HA-AtOFP8與Col和Atofp8-1差異顯著，表明35S∶HA-AtOFP8植株在受到滲透脅迫時，其應(yīng)變能力要強于Atofp8-1和Col植株。

2.6 AtOFP8植株體內(nèi)干旱應(yīng)答基因表達的影響

對Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株干旱應(yīng)答基因的表達量進行檢測，如圖10所示，在對照組中，與Col植株相比，35S∶HA-AtOFP8植株中的AtRD26和AtRDUF2基因的表達量均顯著升高，但在Atofp8-1植株中的AtADH1和AtERD7基因的表達量顯著降低。在干旱處理10 d時，與對照組處理10 d時的植株相比，Col和35S∶HA-AtOFP8植株葉片中AtADH1、AtRD26、AtRDUF2、AtERD7基因的表達量均顯著升高，在Atofp8-1植株葉片中只有AtADH1、AtRD26、AtERD7基因的表達量顯著升高，且在35S∶HA-AtOFP8植株葉片中的AtADH1、AtRD26、AtRDUF2基因的表達量最高，在Atofp8-1植株葉片中的AtADH1、AtRD26、AtRDUF2、AtERD7基因的表達量均最低。

圖9 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株 在干旱處理下可溶性蛋白含量Fig.9 Soluble protein content of Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant under drought stress

圖10 Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP8植株體內(nèi)干旱應(yīng)答基因的表達Fig.10 Expression of drought response genes in Col, Atofp8-1 and 35S∶HA-AtOFP8 plant

3 討論

當(dāng)植物遭受干旱脅迫時，首先植株的外部性狀會發(fā)生變化。干旱脅迫也能對植物的種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制[21]。研究表明，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的聚乙二醇會降低黃秋葵(Abelmoschusesculentus)的種子萌發(fā)率，并且黃秋葵種子萌發(fā)率會隨聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而降低[22]。干旱對小麥(Triticumaestivum)種子萌發(fā)也具有顯著的抑制作用[23]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著甘露醇濃度的升高和干旱處理時間的延長，擬南芥植株的萌發(fā)率均越來越低，這與前人的研究結(jié)果一致[23]，但在干旱脅迫條件下擬南芥植株的萌發(fā)率始終是35S∶HA-AtOFP8>Col>Atofp8-1，說明過表達AtOFP8可以提高干旱條件下擬南芥的萌發(fā)率。植物葉片是對干旱脅迫十分敏感的器官，干旱脅迫下植物生理生化的變化必然會引起葉片形態(tài)的變化，因此，葉片性狀的變化能體現(xiàn)植物對干旱環(huán)境的抵抗能力。干旱脅迫使小麥葉片含水量下降，葉片發(fā)生卷曲，影響光合作用，干物質(zhì)分配比例發(fā)生變化，植株變矮[24]。在本試驗中，Atofp8-1植株葉片表面蠟質(zhì)分布比Col植株少，葉片蒸騰速率更快，體內(nèi)水分散失嚴(yán)重，35S∶HA-AtOFP8的表皮蠟質(zhì)分布比Col植株更多，具有較強的儲水能力，降低蒸騰速率[8];擬南芥植株的綠葉率為35S∶HA-AtOFP8>Col>Atofp8-1，Atofp8-1植株葉片比Col植株更早地表現(xiàn)出萎蔫癥狀，說明35S∶HA-AtOFP8表現(xiàn)出較強的抗旱性。

干旱脅迫可造成植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和積累，ROS的產(chǎn)生可能是植物細胞在非生物脅迫下最早的反應(yīng)之一[25-26]。干旱脅迫引起的植物傷害與ROS傷害有關(guān)，而植物體往往通過提高自身SOD、POD抗氧化酶的活性來清除因逆境脅迫而產(chǎn)生的大量自由基，以增強其抗逆性[27]。植物在逆境脅迫中生成的MDA是細胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一[18]。滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)干旱脅迫的重要調(diào)節(jié)機制，植物通過主動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如脯氨酸和可溶性蛋白來緩解干旱脅迫[28]。綜合分析比較本試驗中擬南芥植株在干旱脅迫下葉片MDA含量、抗氧化酶活性(SOD和POD)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸和可溶性蛋白)含量，35S∶HA-AtOFP8植株對干旱脅迫的適應(yīng)性最強。首先，在同一時間和相同濃度的甘露醇處理條件下，35S∶HA-AtOFP8植株在干旱脅迫下葉片MDA含量最低，說明35S∶HA-AtOFP8植株細胞膜透性損傷最小，并且在35S∶HA-AtOFP8植株葉片中抗氧化酶(SOD和POD)活性積累最高，抗旱性強的植物具有較高的抗氧化酶活性，進一步研究發(fā)現(xiàn)，在35S∶HA-AtOFP8植株葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸和可溶性蛋白)含量最高，脯氨酸和可溶性蛋白作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以提高細胞液濃度，使細胞液與膜外環(huán)境滲透平衡。在相同干旱處理條件下，與Col植株相比，Atofp8-1植株葉片中的MDA含量更高，抗氧化酶活性(SOD和POD)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸和可溶性蛋白)含量積累更少，說明Atofp8-1植株對干旱的適應(yīng)性更低。

植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控脅迫相關(guān)基因的表達進而參與調(diào)控植物的抗逆反應(yīng)[29]。擬南芥乙醇脫氫酶基因(AtADH1)，參與干旱、鹽脅迫和低溫脅迫的過程，干旱脅迫誘導(dǎo)AtADH1基因的表達從而提高擬南芥的抗旱性[30]。AtRD26基因cDNA編碼一個 NAC轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)AtRD26基因的煙草能夠提高對干旱和鹽脅迫的耐受性[31]。和野生型擬南芥相比，AtRDUF2的突變體表現(xiàn)出對ABA途徑敏感性降低的表型，并且顯著降低了對干旱脅迫的耐受性[32]。在擬南芥中，早期脫水脅迫可強烈誘導(dǎo)AtERD7基因的表達[33]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在對照組和干旱處理組中，在擬南芥中過量表達AtOFP8基因均能使干旱應(yīng)答基因的表達量顯著上升。

綜上所述，隨著甘露醇濃度的增加以及干旱處理時間的延長，Col、Atofp8-1和35S∶HA-AtOFP83種擬南芥植株受到不同程度的干旱脅迫損傷。35S∶HA-AtOFP8植株在生理調(diào)控方面具有較強的協(xié)調(diào)能力以及較強的保水能力，具體表現(xiàn)在MDA含量最低、抗酶活性(SOD、POD)最高、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(脯氨酸和可溶性蛋白)含量最多，顯著促進干旱應(yīng)答基因(AtADH1、AtRD26、AtRDUF2、AtERD7)的表達，Atofp8-1植株則表現(xiàn)相反。由此可見，過量表達AtOFP8使擬南芥對干旱的適應(yīng)性提高，可為擬南芥抗旱培養(yǎng)提供一定的依據(jù)。