黑曲霉高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的誘變、篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

孫智 郭金玲 龔大春 古永紅 文曉敏 劉君子 肖玲玲

【摘 要】文章主要是以黑曲霉TJ02為出發(fā)菌對(duì)其的孢子進(jìn)行了硫酸二乙酯化學(xué)的誘變，同時(shí)對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，然后以玉米芯為主要碳源，對(duì)該菌株中的β-葡萄糖苷酶的溫度以及穩(wěn)定性展開(kāi)了測(cè)試。

【關(guān)鍵詞】黑曲霉;β-葡萄糖苷酶;誘變

纖維素酶是一種多組分良好的酶系統(tǒng)。根據(jù)其誘導(dǎo)反應(yīng)的程度，它具有重要的功能。內(nèi)切葡聚糖酶（英文縮寫EG）、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷三種主要類型。酶（縮寫為BG）協(xié)同作用促進(jìn)纖維素的降解而不產(chǎn)生長(zhǎng)纖維聚糖和醛糖。這些糖最終被水解成糖。此外，β-糖苷酶將醋酸時(shí)間內(nèi)迅速釋放的纖維結(jié)構(gòu)半乳糖降解為肝糖原，促進(jìn)其清除。抑制酶組分是水解過(guò)程的最后一步，也是受外界因素制約的最關(guān)鍵因素。纖維素酶的產(chǎn)生菌是木霉菌。所產(chǎn)酶系具有較高的斜葡萄糖寡糖和外源葡萄糖苷酶活性，但β-葡萄糖苷酶數(shù)量相對(duì)不足，生物降解效率和質(zhì)量較低。米曲霉具有獨(dú)特的高β-糖苷酶活性。在酶體系中加入該酶還可以大大提高富含纖維素的核桃木復(fù)合材的速度和效率。本研究通過(guò)硫酸二乙酯的化學(xué)誘變，獲得了一株遺傳基因相對(duì)穩(wěn)定的菌株。優(yōu)化了黑青霉β-糖苷酶高產(chǎn)突變株DES-7，并對(duì)其培養(yǎng)的碳源和氮源進(jìn)行了優(yōu)化。確定了β-葡萄糖苷酶的最適pH和最適室內(nèi)溫度，并測(cè)定了其pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。

1測(cè)定基本情況

1.1黑曲霉致死率的測(cè)定

用氯酸鹽人工誘導(dǎo)tj02黑曲霉。隨著漸進(jìn)突變育種時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)的死亡率會(huì)增加。硫酸乙酯多倍體時(shí)間為10min時(shí)，孢子囊死亡率僅為23.2%;誘變育種時(shí)間延長(zhǎng)至30min時(shí)，孢子囊死亡率提高到85.3%;化學(xué)誘變時(shí)間為40min時(shí)，卵死亡率為95.8%;50 min和60min時(shí)，孢子囊死亡率為95.8%，死亡率在60%以上。根據(jù)死亡率選定硫酸二乙酯，后續(xù)治療時(shí)間為30min[1]。

1.2高β-葡萄糖苷酶活菌株的誘變及篩選

用硫酸二乙酯處理的孢子囊懸浮液包被在PDA板上。隨機(jī)選擇25個(gè)突變株并將其疫苗接種在新的PDA平板設(shè)備上以進(jìn)行重新分離和純化。通過(guò)刮除誘變環(huán)獲得的點(diǎn)突變菌株的孢子囊疫苗在次級(jí)發(fā)酵瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行二次發(fā)酵和連續(xù)培養(yǎng)。確定β-葡萄糖苷酶以進(jìn)行初步篩選。突變體des-7和des-11的酶活性大大提高。

1.3遺傳穩(wěn)定性

通過(guò)這種初步篩選獲得的突變菌株DES-7和DES-11被連續(xù)培養(yǎng)了8代，并確定了親本的遺傳穩(wěn)定性。DES-7的β-葡萄糖苷酶活性比突變體DES-11的穩(wěn)定。與原始菌株TJ02相比，β-葡萄糖苷酶活性提高了30%以上[2]。

1.4碳源對(duì)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響

通過(guò)使用麩皮，芝麻桿，玉米芯（Wangetal，2011），木糖殘?jiān)驼ǖ柠湺?，微晶纖維素等，將一系列最便宜易得的原料用作研究的主要原料，檢測(cè)其對(duì)β-葡萄糖苷酶對(duì)菌株的影響。當(dāng)玉米芯用作碳源時(shí)，分離株發(fā)酵液中的中間蛋白和β-葡萄糖苷酶的生物活性最大，前者為0.48g/L和13.78IU/mL。緊接著進(jìn)行蒸汽噴射的小麥，稻稈和麩皮，其次是玉米。核心是唯一的碳源。研究了相同高濃度對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的影響。以玉米芯為唯一底物，其濃度比對(duì)噬菌體產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的失活有重大影響。當(dāng)玉米芯的濃度為50g/L時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性達(dá)到39IU/ml10。902菌株的生產(chǎn)力將隨著玉米芯濃度比的增加而增加。這可能與絲狀真菌的高密度菌絲有關(guān)[3]。如果底物纏結(jié)的濃度太高，則二次發(fā)酵液相對(duì)較厚，這不利于分離物的產(chǎn)生。與小麥核心（50g/L）作為碳源相比，使用了天然的初始發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米芯核心麩為發(fā)酵底物時(shí)β-葡萄糖苷酶活作為28iu/ml），腸球菌的容量規(guī)模也很差。

1.5氮源對(duì)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響

在恒溫、氮?dú)鉂舛炔蛔兊那疤嵯?，以（NH4）2SO4、（NH4）2CO、NH4COOCH3、NH4Cl、NaNO3、干酵母粉、小麥充分?jǐn)嚢韬陀衩椎暗鞍纂藶閮煞N不同類型，8種成分成為研究芽孢桿菌對(duì)β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響、（NH4）2SO4和復(fù)合肥在無(wú)機(jī)物氮源中對(duì)細(xì)菌酶的產(chǎn)生比三種組分更為不利;考慮到市場(chǎng)因素，（NH4）2SO4是最有利的無(wú)機(jī)復(fù)合氮源;發(fā)酵粉是最好的無(wú)機(jī)相氮源，初始瓊脂培養(yǎng)基中的氮源為（NH4）2SO4與酵母粉混合，發(fā)酵的最佳效果高于多種組分，說(shuō)明（初始液體培養(yǎng)基中的（NH4）2SO4和酵母發(fā)酵粉效果。

1.6β-葡萄糖苷酶表觀酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1 β-葡萄糖苷酶的最適溫度

為了更好地確定β-葡萄糖苷酶的最佳溫度，在不同攝氏度的基本條件下測(cè)量了β-葡萄糖苷酶的酶活性。當(dāng)溫度降至55°C時(shí)，酶的活性可以達(dá)到最高。觀察β-葡萄糖苷酶活性的變化曲線：當(dāng)總溫度低于55℃時(shí)，酶活性隨室內(nèi)溫度的升高而增加;當(dāng)總溫度為60℃時(shí)，酶活性降低。當(dāng)攝氏溫度超過(guò)70°C時(shí)，酶活性急劇上升，降至最佳總溫度的30%。

1.6.2 β-葡萄糖苷酶的最適pH

在pH為2.0-9.0的相同緩沖空間溶液中，準(zhǔn)確地測(cè)定了β-過(guò)氧化物酶的活性物質(zhì)與pH的關(guān)系。由該菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷的活性隨pH而顯著變化，并且其酶活性pH4.0左右是最高的，表明菌株所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶是一種弱酸性的β-葡萄糖苷酶，它的最佳pH值約為4.8。

1.6.3 β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性

測(cè)定β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性，并在37℃、50℃和65℃下測(cè)定β-葡糖苷酶的活性。β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性在37℃時(shí)最好，24hβ-葡萄糖苷酶的活性為95%。溫度到50攝氏度℃是β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性最高，且24小時(shí)內(nèi)β-葡萄糖苷酶的活性為90%。溫度為65時(shí)℃β-葡糖苷酶的穩(wěn)定性較差，β-葡糖苷酶的全活性在6小時(shí)內(nèi)降至0。

1.6.4 β-葡萄糖苷酶的pH穩(wěn)定性

在不同pH條件下于50℃保溫2h后，測(cè)定β-糖苷酶的相對(duì)酶活性。在50℃加熱2h后，β-糖苷酶在pH 4.0至6.0具有良好的穩(wěn)定性，酶活性為大于85%。在pH 8.0的條件下，在50℃下保溫2小時(shí)后，酶活性僅為原始酶的50%。

2討論

β-葡萄糖苷酶也稱為葡糖苷酶水解酶，也稱為龍膽二糖酶，長(zhǎng)纖維二糖酶和苦杏仁苷酶。它屬于蛋白水解酶的類別。來(lái)自相同來(lái)源的芥子油苷酶的分子量和范圍從數(shù)十kDa到數(shù)百kDa。葡糖苷酶最早是在1837年由Liebig和Wohler在苦腰果中發(fā)現(xiàn)的。作為纖維酶的組成部分，芥子油苷的主要基本功能是使非真實(shí)的還原性糖苷鍵與糖鏈末端復(fù)合，并根據(jù)實(shí)際情況釋放葡萄糖和配體。另外，β-葡萄糖苷酶可以弱化對(duì)硝基苯半乳糖不耐受性和脫氫肋骨內(nèi)酯，這在生產(chǎn)實(shí)踐中起著重要作用[4]。β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系統(tǒng)中最重要的酶。當(dāng)乙酸纖維蛋白酶富含纖維素時(shí)，它的重復(fù)使用和葡萄糖苷酶的缺乏將導(dǎo)致大量纖維素二糖積聚。乳糖的大量積累實(shí)際上將對(duì)酶促反應(yīng)形成非常強(qiáng)的即時(shí)反饋抑制作用。纖維素酶水解并顯著增強(qiáng)果膠酶。系統(tǒng)中葡萄糖苷酶的活性對(duì)于提高果膠水解產(chǎn)物的速度和效率以及增加葡萄糖的年產(chǎn)量最為重要。因此，對(duì)葡萄糖苷酶的研究仍具有重要的理論和實(shí)用性。

黑曲霉tj02氯酸鹽的多種化學(xué)誘變方法導(dǎo)致了β-葡萄糖苷酶突變體des-7，并具有較高的穩(wěn)定性。與原始菌株相比，des-7的酶生產(chǎn)能力大大提高了至少30%。在工業(yè)部門，菌株的生產(chǎn)能力是關(guān)鍵點(diǎn)之一，而因素也與產(chǎn)品生產(chǎn)的成本直接相關(guān)。分子遺傳學(xué)技術(shù)的整體發(fā)展取決于基因工程技術(shù)。分離株轉(zhuǎn)化的非凡成就取得了重大突破。因此，基因工程僅限于具有詳細(xì)遺傳基團(tuán)信息和清晰代謝功能和途徑的菌株，而遺傳背景不明確的菌株是沒(méi)有辦法進(jìn)行定向改造。相反，傳統(tǒng)的誘變育種方法如紫外線誘變育種、理化誘變育種等，不需要受到遺傳遺傳學(xué)經(jīng)濟(jì)背景的限制。對(duì)硫酸二乙酯進(jìn)行了化學(xué)和物理誘變育種，獲得了持續(xù)高產(chǎn)的芽孢桿菌，這直接證明了傳統(tǒng)的化學(xué)誘變方法更有效。菌株轉(zhuǎn)化是利用單一重要因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)突變株DES-7的碳源和氮源進(jìn)行充分優(yōu)化的方法。當(dāng)?shù)礊樘鹩衩仔?，氮源為酵母粉和氯化銨時(shí)，β-葡萄糖苷酶活性為39IU/mL，比初始菌株提高了85.7%。確定了β-葡萄糖苷酶的最佳室內(nèi)溫度、最適pH值、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。證明了β-糖苷酶在55℃和pH 5.0時(shí)酶活性最高，在37℃和50℃下保持良好的高可控性，在pH 4.0～6.0時(shí)穩(wěn)定性較好。木質(zhì)膳食纖維的蛋白質(zhì)水解一般在50℃下進(jìn)行，本研究獲得的突變菌株半乳糖在50℃下能保持較高的穩(wěn)定性，可加入到膳食纖維酶系中用于木質(zhì)粗纖維的水解[5]。

3結(jié)語(yǔ)

β-葡萄糖苷酶已在我國(guó)許多行業(yè)中被廣泛應(yīng)用。它具有巨大的商業(yè)形式，潛力無(wú)限。發(fā)酵總體水平低一直是β-葡萄糖苷酶工業(yè)化為能生產(chǎn)的主要原因。當(dāng)前對(duì)于提高β-葡萄糖苷酶對(duì)天然發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了整體優(yōu)化，并對(duì)菌株進(jìn)行了改良。

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