蒼耳子黃酮微膠囊的制備及其在冷鮮肉涂膜保鮮中的應(yīng)用

王菲，霍笑康，汪嘉麒，王戰(zhàn)勇

(遼寧石油化工大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧 撫順 113001)

蒼耳子(中藥名,別名虱馬頭、老蒼子、蒼浪子等[1])為菊科,蒼耳屬，分布于東北三省、內(nèi)蒙古、河北等地，具有散風(fēng)、除濕、通竅之功效[2]。冷鮮肉，別名冷卻肉，即牲畜屠宰后隨即對(duì)其胴體冷卻處理，使其深層溫度降至0～4 ℃，并在后續(xù)的產(chǎn)、儲(chǔ)、運(yùn)、銷的環(huán)節(jié)中，一直置于冷鏈環(huán)境之下的鮮肉[3-5]。冷鮮肉肉質(zhì)更為細(xì)嫩味美，營(yíng)養(yǎng)豐富，水分含量高，故易受到外界微生物和內(nèi)部所含酶類的影響而發(fā)生肉質(zhì)腐敗，影響銷售而造成浪費(fèi)?？梢允褂靡恍┨烊?、無(wú)毒、安全的生物活性成分來(lái)延緩肉質(zhì)腐敗。

蒼耳子中黃酮含量較為豐富，具有較好的抗氧化和抑菌性[6]，但存在溶解性和穩(wěn)定性差的局限性，如果直接用來(lái)對(duì)冷鮮肉進(jìn)行保鮮，很難長(zhǎng)時(shí)間保鮮，使其應(yīng)用范圍受到很大限制。通過(guò)微膠囊的手段[7-11]，將蒼耳子黃酮進(jìn)行包埋處理，從而增加其溶解性和緩釋性，提高黃酮微膠囊產(chǎn)品的穩(wěn)定性，用于冷鮮肉保鮮時(shí)可延緩肉質(zhì)發(fā)生腐敗，延緩保質(zhì)期。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

蒼耳子，購(gòu)于陜西漢中；新鮮豬后腿肉，市售;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純；無(wú)水乙醇、濃鹽酸、Al(NO3)3、NaNO2、NaOH、NaCl、H3BO4、MgO、溴甲酚綠、甲基紅、殼聚糖均為分析純；安琪酵母，購(gòu)于超市；蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、瓊脂粉均為生物試劑；去離子水，實(shí)驗(yàn)室自制。

AR124CN電子天平；UV-2600可見(jiàn)分光光度計(jì)；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵。

1.2 蒼耳子黃酮酵母微膠囊的制備

1.2.1 黃酮提取 按固液比1∶30(g/mL)向蒼耳子粉末中加入75%(V/V)乙醇，于恒溫水浴鍋60 ℃提取2.5 h。離心、取上清、濃縮、冷凍干燥，備用。

1.2.2 酵母細(xì)胞制備 將5%(m/V)NaCl和安琪干酵母按固液比1∶20(g/mL)混合，于恒溫振蕩水浴鍋54 ℃振蕩5 h。離心、水洗2次，冷凍干后得到酵母細(xì)胞[12]。

1.2.3 黃酮微膠囊制備 量取蒼耳子黃酮濃縮液10 mL，加入一定量酵母細(xì)胞，水浴振蕩，離心、水洗3次，凍干后得到蒼耳子黃酮酵母微膠囊。

1.3 保鮮冷鮮肉

采用高壓蒸汽對(duì)實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行滅菌。在無(wú)菌條件下，把冷鮮肉的膜、筋和脂肪清理干凈，等質(zhì)量切塊。實(shí)驗(yàn)分4組，分別為空白組、2%黃酮粗提液組，2%黃酮酵母微膠囊組和2%殼聚糖組。用不同保鮮液浸泡冷鮮肉30 min。取出，瀝干，于自封袋中排氣封口保存，一起同時(shí)放入冰箱冷藏室保存。在第1，3，5，7，9 d取出，測(cè)定、計(jì)算各組相應(yīng)測(cè)定指標(biāo)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 汁液損失率 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天記錄好每組肉塊初始質(zhì)量(m0)和托盤(pán)質(zhì)量(m托)，于第1,3,5,7,9 d取出肉樣，將汁液倒盡、瀝干，對(duì)肉塊和托盤(pán)的總質(zhì)量(w)進(jìn)行稱重，計(jì)算各組的汁液損失率(X%)。

1.4.2 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N) 從各實(shí)驗(yàn)組中分取出10.00 g肉樣剪碎，置于錐形瓶中，加100 mL水，充分搖勻，靜置0.5 h，過(guò)濾、留濾液。按照GB/T 5009.228—2016進(jìn)行操作，硼酸吸收液用0.01 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，出現(xiàn)藍(lán)紫色時(shí)滴定停止，記錄消耗HCl體積，并計(jì)算TVB-N[13]。同時(shí)做好試劑空白。

1.4.3 pH值 每組肉塊中取10.00 g樣品，剪碎，加蒸餾水90 mL，振搖0.5 h。過(guò)濾，測(cè)定濾液pH值。

1.4.4 菌落總數(shù) 從各組中分取10.00 g肉樣，剪碎，放于錐形瓶中，加入0.85%無(wú)菌生理鹽水90 mL，封好瓶口，振搖3 min。取上清液1 mL，按GB 4789.2—2010進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 蒼耳子黃酮微膠囊制備條件優(yōu)化

主要考察芯壁比(黃酮和酵母細(xì)胞的質(zhì)量之比)、振蕩溫度和振蕩時(shí)間3個(gè)因素對(duì)蒼耳子黃酮包埋效果的影響。

2.1.1 芯壁比的影響 將芯壁比設(shè)定為3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，取7份一定質(zhì)量的凍干酵母細(xì)胞，分別按上述比例倒入10 mL蒼耳子黃酮粗提液，恒溫水浴60 ℃振搖6 h，離心，取沉淀，凍干，計(jì)算包埋率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 芯壁比的影響Fig.1 Effect of core wall

由圖1可知，隨芯壁比增加，包埋率先增長(zhǎng)而后趨于平衡。出現(xiàn)這種情況的原因是壁材對(duì)芯材即酵母細(xì)胞對(duì)蒼耳子黃酮具有一定程度的包埋力，壁材少，包埋不完全，壁材適當(dāng)，包裹合適，壁材過(guò)多，就會(huì)造成浪費(fèi)，包埋效果也不好[15]。故芯壁比在1∶3～1∶5較為適宜。

2.1.2 振蕩時(shí)間的影響 稱取5份一定質(zhì)量的酵母細(xì)胞，按芯壁比1∶1倒入10 mL蒼耳子黃酮提取液，于60 ℃水浴振蕩2，4，6，8，10 h，離心，取沉淀，凍干，計(jì)算包埋率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 振蕩時(shí)間的影響Fig.2 Effect of vibration time

由圖2可知，隨振蕩時(shí)間延長(zhǎng)，包埋率先增大后減小，于6 h達(dá)到最大。主要是由于蒼耳子黃酮的擴(kuò)散隨振蕩時(shí)間增大而加速，有利于酵母細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行包埋，故包埋率逐漸變大；但是振蕩時(shí)間過(guò)久，反而又使被包埋好的黃酮從壁材中擴(kuò)散出來(lái)，包埋率迅速降低。故振蕩時(shí)間在5～7 h比較適宜。

2.1.3 振蕩溫度的影響 稱取5份一定質(zhì)量的酵母細(xì)胞，按芯壁比1∶1加入10 mL蒼耳子黃酮濃縮液，分別在30，40，50，60，70 ℃，振蕩6 h。離心，取沉淀，凍干，計(jì)算包埋率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 振蕩溫度的影響Fig.3 Effect of vibration temperature

由圖3可知，隨振蕩溫度升高，包埋率先增大后減小，于40 ℃時(shí)達(dá)到最大。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是，隨振蕩溫度升高，黃酮分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，有利于其被包埋，故而增大包埋率；但振蕩溫度過(guò)高會(huì)干擾酵母的成膜性，使得包埋率降低[16]。故振蕩溫度在30～50 ℃較為合適。

2.1.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取芯壁比、振蕩時(shí)間和振蕩溫度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，考察其對(duì)包埋率的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The result of orthogonal test

由表1可知，最佳水平組合是A1B3C1，即芯壁比1∶3，振蕩時(shí)間為7 h，振蕩溫度為30 ℃。在此組合條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到包埋率依次為50.32%，53.33%，51.78%，平均為51.8%，大于表中各條件下的包埋率，故此條件為蒼耳子黃酮酵母微膠囊制備條件的最適條件。3個(gè)因素對(duì)包埋率的影響程度依次為：芯壁比>振蕩溫度>振蕩時(shí)間。

2.2 冷鮮肉保鮮效果

2.2.1 汁液損失率 冷鮮肉在加工和儲(chǔ)運(yùn)中會(huì)出現(xiàn)水分揮發(fā)、汁液流失的問(wèn)題，使得肉質(zhì)感官變差、營(yíng)養(yǎng)破壞，喪失商業(yè)價(jià)值[17]。所以可以用該指標(biāo)來(lái)判斷冷鮮肉的汁液損失情況，見(jiàn)圖4。

圖4 汁液損失率Fig.4 The juice loss rate

由圖4可知，冷鮮肉隨保藏時(shí)間越長(zhǎng)，汁液損失逐漸增大。在前7 d，汁液損失較少的是經(jīng)酵母微膠囊和殼聚糖處理過(guò)的冷鮮肉，對(duì)于短時(shí)間貯存，酵母微膠囊的保水力較好。因?yàn)闅ぞ厶堑某赡ば?，使得即使延長(zhǎng)儲(chǔ)存時(shí)間，其仍然可以很好的保護(hù)冷鮮肉，防止水分揮發(fā)損失，故殼聚糖組汁液損失最少[12]。隨后依次為：微膠囊組、空白組和黃酮濃縮液組。綜上分析可知，酵母微膠囊及殼聚糖都有一定的持水作用，且酵母微膠囊的保水效果稍差于殼聚糖。

2.2.2 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N) 即為蛋白質(zhì)被酶或微生物作用而生成的揮發(fā)性的堿性含氮化合物，如氨及胺類等，由此來(lái)鑒定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的變質(zhì)情況[18]。依據(jù)GB/T 9959.2—2008《分割鮮、凍豬瘦肉》，若TVB-N值>15 mg/100 g則肉發(fā)生變質(zhì)[19]，見(jiàn)圖5。

由圖5可知，3個(gè)保鮮劑組的TVB-N低于空白組，且保鮮效果相似，在實(shí)驗(yàn)的9 d中，TVB-N均一直低于15 mg/100 g，表明肉質(zhì)未發(fā)生腐敗?？瞻捉M從第7 d開(kāi)始，TVB-N>15 mg/100 g，表明肉質(zhì)已開(kāi)始腐敗變質(zhì)。微膠囊組在第11 d時(shí)，TVB-N是15.54 mg/100 g，才發(fā)生變質(zhì)，保鮮效果最好。結(jié)果表明，酵母微膠囊與殼聚糖都能有效抑制蛋白質(zhì)分解，使冷鮮肉達(dá)到保鮮的目的，且蒼耳子黃酮微膠囊可抑制TVB-N產(chǎn)生，且效果稍好于殼聚糖。

圖5 揮發(fā)性鹽基氮Fig.5 TVB-N

2.2.3 pH值 由于冷鮮肉在儲(chǔ)存時(shí)會(huì)受到酶及微生物分解作用，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，導(dǎo)致pH值不斷增大，影響冷鮮肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和銷售價(jià)值，故測(cè)定pH值這一指標(biāo)可以判斷肉質(zhì)的變化[18]。依據(jù)GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測(cè)定》中，新鮮肉pH 5.8～6.2，次鮮肉pH 6.3～6.6，變質(zhì)肉pH>6.7[20],見(jiàn)圖6。

圖6 各實(shí)驗(yàn)組中pH的變化Fig.6 Changes of pH in each experimental group

由圖6可知，4組冷鮮肉pH隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增大，但程度不同。未經(jīng)任何處理的空白組，pH值增長(zhǎng)最快，且從第4～5 d開(kāi)始變質(zhì)。隨后依次為微膠囊、殼聚糖和黃酮濃縮液組，且這3組在整個(gè)11 d的實(shí)驗(yàn)中pH均低于6.6，未發(fā)生變質(zhì)。其中，控制pH值效果最好的是黃酮濃縮液。主要由于黃酮濃縮液中黃酮含量高，能充分抑制微生物生長(zhǎng)繁殖，從而減緩其對(duì)蛋白質(zhì)的分解破壞。此外，微膠囊對(duì)黃酮具有很好的緩釋作用，逐漸釋放黃酮已達(dá)到長(zhǎng)久抑菌的目的，從而降低TVB-N等堿性物質(zhì)的形成，較好的控制pH值。而殼聚糖由于自身較好的成膜性，從而隔絕氧氣達(dá)到抑菌效果，減少蛋白質(zhì)被分解的程度。綜上所述，黃酮酵母微膠囊與殼聚糖相似，都能較好地控制冷鮮肉的pH值，起到保護(hù)作用。

2.2.4 菌落總數(shù) 肉質(zhì)腐敗變質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)(按菌落總數(shù)計(jì))為：一級(jí)鮮肉≤104cfu/g,二級(jí)鮮肉104～106cfu/g,腐敗肉>106個(gè)/g[19],見(jiàn)圖7。

圖7 各實(shí)驗(yàn)組中菌落總數(shù)的變化Fig.7 Changes of colonies number in each experimental group

由圖7可知，隨貯存時(shí)間增加，菌落總數(shù)不斷增多。其中，在第3 d時(shí)，空白組菌落總數(shù)>106個(gè)/g，即已經(jīng)發(fā)生腐?。辉诘? d時(shí)，黃酮濃縮液組開(kāi)始變質(zhì)；殼聚糖組從第9 d開(kāi)始變質(zhì)；但在第9 d時(shí)，微膠囊組菌落總數(shù)仍小于106個(gè)/g，處于二級(jí)鮮肉狀態(tài)，到第11 d開(kāi)始變質(zhì)，菌落總數(shù)僅為6.45 lgcfu/g。

綜上所述，4種保鮮液對(duì)冷鮮肉都有較好的抑菌作用，其中微膠囊的效果最好。

3 結(jié)論

(1)制備蒼耳子黃酮酵母微膠囊的最佳條件為：芯壁比1∶3，振蕩時(shí)間7 h，振蕩溫度30 ℃，所得微膠囊的包埋率最大，可達(dá)51.8%。

(2)3種保鮮液均對(duì)冷鮮肉有一定保鮮作用，其中，黃酮酵母微膠囊與殼聚糖的保鮮效果較為接近，對(duì)冷鮮肉具有良好的保鮮效果，可保鮮9 d左右。