白菊濕疹膏安全性實(shí)驗(yàn)研究

史向華，續(xù) 艷，牛 丹，薛潤苗，楊文彬，柴秋彥，張俊榮

（1.山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西太原030006； 2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

濕疹是由多種內(nèi)外因素引起的瘙癢劇烈的一種過敏性皮膚炎癥反應(yīng)，是一種遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。臨床上以紅斑、丘疹、丘皰疹為主，病程不規(guī)則，呈反復(fù)發(fā)作，難根治，對患者正常工作和生活造成巨大影響。目前常用的西藥主要有糖皮質(zhì)激素類、抗組胺類、類激素類藥物等，盡管可以快速緩解癥狀，但長期使用，副作用較大。白菊濕疹膏是在臨床驗(yàn)方的基礎(chǔ)上研制而成的中藥制劑，療效確切。本研究主要評價白菊濕疹膏對家兔及豚鼠皮膚的致敏作用，以及小鼠灌胃給藥和皮膚給藥的安全性，并為臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 白菊濕疹膏（主要由白菊、苦參和黃連等中藥組成），中國人民武裝警察部隊藥品儀器檢定所提供（樣品為淡棕褐色軟膏，純度：99.1%，置冰箱中備用）。復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（999皮炎平）30 g，深圳三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：H44024170。二甲苯：衡陽有機(jī)試劑廠生產(chǎn)，批號：20100327。2，4-二硝基氯苯（DNCB）：中國醫(yī)藥公司北京分公司，批號：20101026。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SPF昆明種（KM）小鼠，112只，體質(zhì)量（20-25）g，雌雄各半，由山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號：SYXK（晉）2017-0001。豚鼠，16 只，體質(zhì)量（350±10）g，雌雄各半，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK（京）2011-0010。新西蘭白兔，24只，雌雄各半，體質(zhì)量（2-2.5）kg，北京科宇動物養(yǎng)殖中心提供，合格證號SCXK（京）2007-003。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 方法參照文獻(xiàn)。找出引起小鼠100%和0死亡的劑量。取12只小鼠，體質(zhì)量（20～25）g，隨機(jī)分為3組，每組4只，雌雄各2只，分別按體質(zhì)量40 mL/kg、20 mL/kg、10 mL/kg的劑量經(jīng)口給藥，給藥前12 h禁食、不禁水，給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，并觀察小鼠 3 d 內(nèi)死亡情況［1-2］。

1.2.1.2 最大給藥量實(shí)驗(yàn) 方法參照文獻(xiàn)。取小鼠 60 只，體質(zhì)量（20～25）g，隨機(jī)分為 3 組：對照組、空白基質(zhì)組（凡士林40 mL/kg）和白菊濕疹膏組（40 mL/kg），每組20只，雌雄各10只。按上述劑量1次灌胃給藥，對照組給予同體積蒸餾水。各組小鼠給藥前禁食12 h，不禁水，給藥后常規(guī)飼養(yǎng)。連續(xù)觀察7 d內(nèi)小鼠的中毒反應(yīng)及死亡情況，如無死亡，則此用藥量即為小鼠的最大給藥量［2］。計算灌胃給藥組小鼠的最大給藥量為擬臨床用藥劑量的倍數(shù)。

1.2.1.3 皮膚給藥對小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn) 方法參照文獻(xiàn)。取KM 種小鼠40只，體質(zhì)量（18～22）g，隨機(jī)分為兩組，即基質(zhì)對照組、白菊濕疹膏組，每組20只；實(shí)驗(yàn)前小鼠背部正中剪毛后，以8%硫化鈉溶液脫毛，面積約2.5 cm×4 cm，24 h后用于實(shí)驗(yàn)［3-4］。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，在小鼠背部脫毛區(qū)分別涂抹基質(zhì)和白菊濕疹膏，給藥量為25 g/kg，給藥后連續(xù)觀察7 d，記錄動物死亡數(shù)及毒性反應(yīng)。

1.2.2 家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn) 方法參照文獻(xiàn)［2］。新西蘭白兔 16 只，體質(zhì)量（2～2.5）kg，雌雄各半，采用自身對照，設(shè)單次給藥完整皮膚組、單次給藥破損皮膚組、多次給藥完整皮膚組和多次給藥破損皮膚組，分別進(jìn)行單次和多次給藥皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)。于實(shí)驗(yàn)前1 d，將每只家兔背部脊柱兩側(cè)去毛（每側(cè)約3 cm×3 cm，無紅斑、水腫及破損），再用8%Na2S水溶液脫毛。全部受試家兔去毛后，單籠飼養(yǎng)每只家兔。破損皮膚組的制作：先將針頭用75%酒精消毒，然后在每只家兔背部兩側(cè)去毛區(qū)皮膚處劃“#”字以滲血為度。單次給藥完整皮膚組、單次給藥破損皮膚組，以脊柱為分割線分為左右兩側(cè)受試區(qū)，每側(cè)受試區(qū)又分為兩部給藥區(qū)（左一為白菊濕疹膏0.2 g/3×3 cm組，左二為白菊濕疹膏0.4 g/3×3 cm組，右一為空白對照組，右二為基質(zhì)0.4 g/3×3 cm組），涂抹用藥后，用一層5 cm×5 cm保鮮膜覆蓋保濕，再加無菌紗布覆蓋，最后用醫(yī)用膠布和繃帶適當(dāng)固定。涂抹后6 h，用溫水洗去殘留受試藥，觀察受試部位1，24，48，72 h有無紅斑及水腫。

多次給藥完整皮膚組和多次給藥破損皮膚組分組及給藥方法同上，每天1次，連續(xù)7 d。每次涂抹后6 h，洗去殘留涂抹物，在洗去涂抹物后1 h及再次給藥前觀察紅斑、水腫等，并對紅斑、水腫進(jìn)行評分。末次用藥后去除受試物，觀察涂抹部位1，24，48，72 h有無紅斑和水腫等情況以及上述變化的恢復(fù)。多次皮膚刺激實(shí)驗(yàn)中每天每只動物平均積分=（紅斑形成總分+水腫形成總分）／（合計動物數(shù)×7）。所有動物均用數(shù)碼相機(jī)拍照，根據(jù)上述公式計算平均積分值，按照皮膚刺激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)及皮膚刺激強(qiáng)度評價標(biāo)準(zhǔn)［5-6］，對刺激強(qiáng)度進(jìn)行評分。

1.2.3 豚鼠皮膚過敏實(shí)驗(yàn) 方法參照文獻(xiàn)［7］。24只豚鼠，體質(zhì)量（350±10）g，按體質(zhì)量、性別隨機(jī)分成4組，分別為空白對照組、白菊濕疹膏組（用藥組）、基質(zhì)組及陽性對照組（0.1%2，4-二硝基氯代苯）。于實(shí)驗(yàn)前1 d，采用8%Na2S水溶液對受試豚鼠背部脊柱兩側(cè)去毛（每側(cè)約3 cm×3 cm，無紅斑、水腫及破損）。將白菊濕疹膏0.2 g、基質(zhì)0.2 g、1%的2，4-二硝基氯代苯0.2 mL（臨用時用丙酮配制，致敏濃度）分別涂于各組動物的左側(cè)脫毛區(qū)（空白對照組不做處置），固定6 h后擦去殘留受試藥，第7天和14天以同樣方法重復(fù)，此為接觸致敏。

于末次涂藥后14 d進(jìn)行激發(fā)致敏，各組動物分別在右側(cè)脫毛區(qū)涂生理鹽水白菊濕疹膏0.2 g，基質(zhì)0.2 g，陽性對照組涂以2，4-二硝基氯代苯（0.1%）0.2 mL（臨用時用丙酮配制）。6 h后去除涂抹物，立即觀察，并于24，48，72 h重復(fù)觀察涂抹部位有無紅斑和水腫等過敏反應(yīng)癥狀。參照文獻(xiàn)［5-6］，按照皮膚過敏性反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)及皮膚過敏性反應(yīng)評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行過敏反應(yīng)評分。過敏反應(yīng)平均積分=（紅斑形成總分+水腫形成總分）／合計動物數(shù)；致敏率（%）=出現(xiàn)皮膚紅斑和水腫的動物數(shù)／受試動物總數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，12只小鼠均無死亡，無法測出其半數(shù)致死量（LD50），采用最大給藥量來評價受試藥物對小鼠的急性毒性作用。

2.1.2 最大給藥量實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，空白基質(zhì)組、白菊濕疹膏組和對照組，按上述劑量灌胃給藥后30 min內(nèi)，部分小鼠活動偶有減少，至1 h后完全恢復(fù)。給藥期間，小鼠整體體重平穩(wěn)增長，飲食、皮膚與毛發(fā)、行為、活動、分泌物、排泄物等均未見明顯異常，14 d內(nèi)動物均無中毒反應(yīng)及死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死全部動物，解剖，肉眼觀察，各鼠組織器官未見明顯異常。表明白菊濕疹膏灌胃給藥小鼠無明顯急性毒性，其對小鼠灌胃的最大給藥量為40 mL/kg或40 g/kg。參照文獻(xiàn)計算灌胃給藥組小鼠的最大給藥量為擬臨床用藥劑量的1600倍［5］。

2.1.3 皮膚給藥對小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，白菊濕疹膏皮膚給藥60 min內(nèi)，部分小鼠活動偶有減少，出現(xiàn)感覺不適癥狀（舔、用后肢撓背部涂藥處），2 h后完全恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)觀察期間小鼠飲食、行為、活動等均未見明顯異常，口、鼻、耳、眼無異常分泌物，排泄物（大小便）等均正常。用藥處皮膚未見有紅腫、滲出及潰爛等異常改變。實(shí)驗(yàn)7 d時，脫毛處皮膚毛發(fā)已經(jīng)全部長出，皮膚光滑平整，給藥組同基質(zhì)組比較無明顯差異，實(shí)驗(yàn)期間無動物死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死全部動物，解剖、觀察各鼠組織器官未見明顯異常。

2.2 家兔皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果顯示，對家兔破損皮膚和完整皮膚單次或多次涂抹白菊濕疹膏或基質(zhì)后6 h、24 h、48 h、72 h的刺激反應(yīng)評分均為0分。

2.3 豚鼠皮膚過敏實(shí)驗(yàn)

結(jié)果見表1。在整個觀察過程中，白菊濕疹膏組和基質(zhì)組未見受試區(qū)出現(xiàn)紅斑及水腫，陽性對照組自激發(fā)給藥6 h后受試區(qū)出現(xiàn)輕度紅斑，無水腫，致敏率100%。白菊濕疹膏對豚鼠致敏率為0，反應(yīng)平均值為0，表明無致敏性，而2，4-二硝基氯化苯致敏率為100%，為極度致敏性。

表1 對豚鼠皮膚過敏實(shí)驗(yàn)的影響

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，KM小鼠口服給藥白菊濕疹膏組不能求得LD50，其最大給藥量為40.00 mL/kg，此劑量約為（兒童按20 kg體質(zhì)量計算）臨床擬用劑量（0.025 mL/kg）的1600倍。皮膚給藥白菊濕疹膏組不能求得LD50，其最大給藥量為25.00 g/kg，此劑量約為（兒童按20 kg體質(zhì)量計算）臨床擬用劑量（0.025 g/kg）的1000倍。白菊濕疹膏在本實(shí)驗(yàn)條件下，對家兔破損和完整皮膚、單次或多次涂抹白菊濕疹膏，刺激反應(yīng)評分均為0分，表明白菊濕疹膏對家兔破損皮膚和完整皮膚、單次或多次涂抹均無刺激性。白菊濕疹膏對豚鼠致敏率為0，反應(yīng)平均值均為0，顯示無致敏性，而2.4-二硝基氯化苯致敏率為100%，為極度致敏性［4］。

急性毒性實(shí)驗(yàn)、皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)、皮膚致敏實(shí)驗(yàn)是新藥臨床前安全性評價的重要組成部分，在本實(shí)驗(yàn)所用劑量范圍內(nèi)，白菊濕疹膏對皮膚無毒性、無刺激性、無致敏性，表明其使用安全，無毒副作用。綜上所述，白菊濕疹膏經(jīng)皮膚給藥安全性好。