蜂蜜中α-淀粉酶活力測(cè)定方法改進(jìn)

陳雪洋　田珂雪

摘要：用分光光度法測(cè)定蜂蜜可溶性淀粉溶液真空冷凍干燥后α-淀粉酶值的穩(wěn)定性，并在掃描電鏡下觀察，與原可溶性淀粉顆粒進(jìn)行形貌特征比較。用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)該測(cè)定方法驗(yàn)證表明，真空冷凍干燥的淀粉可以對(duì)蜂蜜α-淀粉酶進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果穩(wěn)定性好，為制作蜂蜜快速檢測(cè)試劑盒提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蜂蜜;冷凍干燥;α-淀粉酶活力;測(cè)定方法改進(jìn)

蜂蜜是我們生活中常見(jiàn)的天然營(yíng)養(yǎng)佳品，含有與人體血清濃度相近的多種無(wú)機(jī)鹽、維生素及鐵、鈣、銅、錳等等多種有益人體健康的微量元素，具有滋養(yǎng)、潤(rùn)燥、解毒、美白養(yǎng)顏、潤(rùn)腸通便等功效，對(duì)少年兒童咳嗽有一定治療效果，還有抗菌、改善新陳代謝、增強(qiáng)體質(zhì)、提高人體免疫力、抑制腫瘤等藥理作用。一些被利益驅(qū)使的商人通過(guò)在蜂蜜中加入葡萄糖、果糖、高果玉米糖漿等價(jià)格低廉的甜味物質(zhì)來(lái)提高蜂蜜的產(chǎn)量。目前也有許多種鑒別蜂蜜的方法，但是都有一定缺陷。真蜂蜜具有花蜜和蜜蜂的某些特殊成分，摻假蜂蜜的這些特殊成分含量則降低。本文選擇其中的α-淀粉酶作為研究對(duì)象，測(cè)定蜂蜜中α-淀粉酶的活性，就能準(zhǔn)確辨別蜂蜜的真假。

現(xiàn)有測(cè)定蜂蜜中淀粉酶活性方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中用酶的底物是可溶性淀粉溶液，每次測(cè)定時(shí)所用的淀粉溶液都需當(dāng)天配置，相對(duì)麻煩，且每次所用溶液的量不多，而配置的用不完的試劑經(jīng)常倒掉造成了淀粉溶液的浪費(fèi)，并污染環(huán)境。真空冷凍干燥后的物品一般情況下保存時(shí)間長(zhǎng)，性質(zhì)基本不變。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)把可溶性淀粉溶液進(jìn)行冷凍干燥保存，每次使用時(shí)只需要稱取所需的量再加適量的蒸餾水溶解即可，不僅節(jié)約成本和時(shí)間，并可避免淀粉溶液的浪費(fèi)。

天然蜂蜜中α-淀粉酶最適溫度40℃左右，隨溫度的上升酶活下降很快。摻假蜂蜜中添加的中溫α-淀粉酶耐高溫特性較強(qiáng)，最適溫度60℃。為此，本方法測(cè)定40℃及60℃的酶活性，如果60℃還有酶活性，說(shuō)明蜂蜜樣品中加入了工業(yè)淀粉酶，應(yīng)為摻假蜂蜜。

一、材料與方法

（一）材料

試驗(yàn)原料有：槐花蜂蜜，山花蜂蜜，荊條蜂蜜。主要試劑（分析純）有：碘、碘化鉀、乙酸鈉、冰乙酸、氯化鈉、可溶性淀粉。

主要儀器有：unic7200可見(jiàn)分光光度計(jì);電子萬(wàn)用爐;HH-6恒溫水浴鍋;PL303電子天平;pHS-3C精密pH;Quanta 200掃描電子顯微鏡;真空冷凍干燥儀FD-1D-50。

（二）試驗(yàn)方法

1、淀粉溶液的標(biāo)定與配制。采用GB/T 18932.16-2003中淀粉溶液的標(biāo)定方法;對(duì)蜂蜜樣品采用GB/T18932.16-2003蜂蜜中淀粉酶值的測(cè)定方法配制溶液，測(cè)定α-淀粉酶。

2、凍干淀粉的制備。將所制淀粉溶液30mL，置于-80℃的冰箱中預(yù)凍，凍好后在真空冷凍干燥機(jī)中干燥49h。干燥條件：樣品溫度20℃，冷阱溫度-60℃，真空度1Pa。測(cè)定其水分含量≤5%，符合試劑中的水分含量標(biāo)準(zhǔn)，所以對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大。取出后存放在冰箱中備用。制備凍干淀粉溶液時(shí)，稱取冷凍干燥的淀粉0.1g于試管中，加入5mL蒸餾水，使其溶解完全。

3、淀粉顆粒電鏡觀察。將凍干淀粉與原可溶性淀粉樣品置于掃描電子顯微鏡下觀察，拍攝具有代表性的淀粉顆粒的形貌特征。

二、結(jié)果與分析

（一）淀粉溶液的標(biāo)定與冷凍干燥

按照淀粉溶液的標(biāo)定方法，在配制的淀粉溶液中逐漸加入不同量的水，用分光光度計(jì)在660 m波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，確定稀釋系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，加水23mL時(shí)吸光度在0.760±0.02之間，所以在樣品測(cè)定時(shí)稀釋系數(shù)為23mL。

淀粉溶液冷凍干燥后肉眼觀察的形貌如圖1。由圖1可以看出，淀粉冷凍干燥后體積膨脹變大，相互連在一起，不再呈現(xiàn)松散的顆粒狀。

（二）淀粉冷凍干燥前后的電鏡觀察

由圖2（b）可以看出，原可溶性淀粉呈現(xiàn)多角或不規(guī)則橢圓形，是分散開(kāi)的一個(gè)個(gè)淀粉顆粒，大小不一，表面光滑，結(jié)構(gòu)比較緊密，直徑大約有50μm;圖2（a）可以看出，真空冷凍干燥的糊化淀粉具有疏松膨脹的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有些呈片狀結(jié)構(gòu)，片狀結(jié)構(gòu)較薄，片形不規(guī)則，大小不一，互相疊在一起。這種疏松多孔的結(jié)構(gòu)狀態(tài)容易與水充分接觸，可以加快淀粉的吸水速度，提高了溶解效率，且能更好被酶解，有利于試驗(yàn)的進(jìn)行。

（三）淀粉冷凍干燥前后蜂蜜樣品中淀粉酶值測(cè)定結(jié)果的比較

按照α-淀粉酶的測(cè)定方法，用凍干淀粉溶液與原淀粉溶液分別測(cè)定三種蜂蜜樣品中α-淀粉酶的活性，見(jiàn)表2。

由表2可以看出，淀粉冷凍干燥前后測(cè)定的蜂蜜樣品中α-淀粉酶的活性無(wú)顯著差異，表明冷凍干燥的淀粉可以用于蜂蜜中α-淀粉酶的測(cè)定。

（四）真空冷凍干燥淀粉隨溫度變化的穩(wěn)定性試驗(yàn)

把凍干淀粉分別置于0℃、10℃、20℃、30℃和40℃環(huán)境下保存一天，測(cè)定三種蜂蜜樣品的淀粉酶活性值，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，冷凍干燥過(guò)的淀粉在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃存放下三種蜂蜜中淀粉酶值的測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.9%、1.7%、3.7%。說(shuō)明冷凍干燥過(guò)的淀粉在不同溫度下性質(zhì)比較穩(wěn)定，比較容易保存。

（五）真空冷凍干燥淀粉隨時(shí)間變化的穩(wěn)定性試驗(yàn)

冷凍干燥過(guò)的淀粉放在冰箱中保存，分別在一周、二周、三周、四周時(shí)取出測(cè)定三種蜂蜜樣品淀粉酶值，結(jié)果如表5。

由表5可知，淀粉經(jīng)冷凍干燥之后穩(wěn)定性較好，隨時(shí)間的變化，三種蜂蜜樣品淀粉酶值的測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1%、2.0%、3.1%?；旧喜挥绊懛涿郐?淀粉酶的測(cè)定，可以長(zhǎng)期保存、使用。

三、結(jié)論

把可溶性淀粉溶液用真空冷凍干燥法干燥后，性質(zhì)穩(wěn)定，隨溫度和時(shí)間的變化，對(duì)蜂蜜中α-淀粉酶值的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響。對(duì)凍干淀粉進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)淀粉的形貌發(fā)生了很大變化，糊化的淀粉吸水溶脹而相互交聯(lián)成片狀結(jié)構(gòu)，更容易溶于水，且能更好地被酶作用，提高反應(yīng)效率。本試驗(yàn)將淀粉冷凍干燥后，使用時(shí)直接定量稱取，試驗(yàn)更加方便、快捷，簡(jiǎn)化了國(guó)標(biāo)測(cè)定蜂蜜中α-淀粉酶值的方法。同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性良好，可以滿足對(duì)樣品的檢測(cè)，為進(jìn)一步制作蜂蜜快速檢測(cè)試劑盒提供依據(jù)。

（責(zé)任編輯 曹雯梅）