雞Toll樣受體15單克隆抗體的制備及其初步應(yīng)用

李夢妮，王 航，傅思瑤，楊梓純，許炎輝，樊毛迪，高 崧，劉秀梵

(揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽用生物制劑創(chuàng)制重點實驗室，揚州 225009)

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)中，Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是研究熱點之一。TLRs作為一種Ⅰ型跨膜糖蛋白模式識別受體，是動物天然免疫中的第一道屏障[1]。TLRs作為機體炎性反應(yīng)鏈的啟動蛋白可對病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)進行識別，來參與天然免疫這一過程[2]。PRRs可由多種類型的細胞表達，如巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、上皮細胞、成纖維細胞[3]。TLRs可以在巨噬細胞中表達，TLRs通過與PAMPs或配體結(jié)合將巨噬細胞激活。PAMPs主要包括脂多糖、脂磷壁酸、聚肌苷酸、肽聚糖、鞭毛蛋白和單、雙鏈RNA或DNA等[4-5]。TLRs可以激活相關(guān)信號分子，通過招募相關(guān)接頭蛋白(TICAM-2、SARM、TICAM-1、MyD88和TIRAP/MAL)使得胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和表達出各種炎性介質(zhì)，隨之相應(yīng)非特異性和特異性免疫被激活，以至于能夠?qū)⒏腥镜牟≡w清除[6]。然而，TLRs與細菌感染之間緊密相連，對其進行深入研究可在細菌感染機制，疾病的預防、診斷與治療方面具有重要意義。

目前，在禽類發(fā)現(xiàn)的10種TLRs：TLR1La/1Lb、TLR2a/2b、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21[7]。ChTLR15由胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)3部分組成。胞外區(qū)由14～32個亮氨酸重復排列組成N末端結(jié)構(gòu)域，該亮氨酸殘基形成的疏水界面有助于各蛋白之間的黏附，直接影響TLRs對PAMPs的識別[8]。胞內(nèi)C端TIR結(jié)構(gòu)域是與下游蛋白激酶作用的關(guān)鍵元件，它結(jié)合下游所遞呈的分子，與接頭蛋白相互識別，從而促使下游信號轉(zhuǎn)導[9]?？缒^(qū)域貫穿于前兩者，富含半胱氨酸殘基。目前，有研究者在釘螺中也發(fā)現(xiàn)了TLR15的存在[10]，推翻了TLR15為禽類特有這一結(jié)論[11]，其作用機制、生物學功能有待深入研究[12]。ChTLR15在天然免疫中發(fā)揮重要作用，其如何參與免疫應(yīng)答、保護機體方面已有一定的研究基礎(chǔ)[13]。因此，作者通過對雞TLR15部分胞外區(qū)基因克隆，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，表達、純化重組蛋白后免疫小鼠，制備針對ChTLR15的單克隆抗體，并定位其抗原表位，同時檢測TLR15在HD11細胞和雞部分組織中的分布情況，為ChTLR15蛋白生物學功能和禽類TLRs免疫調(diào)節(jié)機制相關(guān)的研究提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、細胞 APEC O1血清型E516株、載體pET-30a、骨髓瘤細胞系SP2/0均由揚州大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽用生物制劑創(chuàng)制重點實驗室保存。

1.1.2 實驗動物 6～8周齡BALB/c雌鼠、ICR小鼠均購自揚州大學比較醫(yī)學中心。

1.1.3 主要試劑 100×HT培養(yǎng)基、50×HAT培養(yǎng)基均購自Gibco公司；DMSO、弗氏完全佐劑、單克隆抗體亞類鑒定試劑盒、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；凝膠過濾層析柱及填料購自GE Heathcare；HRP標記的羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗鼠IgG購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 表達抗原序列的確定 利用Bepipred(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)網(wǎng)站對雞TLR15胞外區(qū)進行抗原表位的預測，以確定表達抗原的序列。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET-30a-ChTLR15(162—386 aa)的構(gòu)建 從雞HD11細胞中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用諾唯贊ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit說明書設(shè)計引物，F(xiàn)：5′-ACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTTGG-AAGATCCACCCAATCCAGGA-3′；R：5′-TGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTCTGGAAGGC-TTTCGATGGGTGTAC-3′。NdeI/XhoI酶切載體pET-30a，根據(jù)ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit說明書將酶切后的載體直接與PCR擴增后的目的片段進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-ChTLR15(162—386 aa)。

1.2.3 重組蛋白誘導表達與純化 重組表達菌pET-30a-ChTLR15(162—386 aa)涂布在(Kan)LB瓊脂平板上培養(yǎng)，挑單菌落接入(Kan)LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以1%的接種量轉(zhuǎn)接至1 L(Kan)LB液體培養(yǎng)基中，待OD600 nm達到0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)5 h后收集菌液。使用超聲波裂解儀對誘導表達的菌液進行冰浴超聲裂解，4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min， 分別取其菌體以及離心后的上清與沉淀進行蛋白表達形式分析。若為包涵體表達，則采用尿素梯度透析復性法對其進行復性[14]。將復性后的蛋白使用Ni-NTA親和層析初次純化,收集初次純化后的蛋白使用葡聚糖凝膠Superdex 200色譜柱進行凝膠過濾層析，進行再次純化，最終獲得較純凈的ChTLR15重組蛋白。通過SDS-PAGE電泳法檢測蛋白純度，再用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度后，分裝，置-70 ℃冰箱保存。

1.2.4 免疫方案 對6～8周齡BALB/c雌鼠進行背部皮下免疫，劑量為每只100 μg。首次免疫將免疫原與弗氏完全佐劑等體積混合，并用生物組織勻質(zhì)器充分乳化蛋白；后續(xù)兩次免疫用弗氏不完全佐劑等體積混合免疫原蛋白；細胞融合前3 d加強免疫，不加佐劑，采用生理鹽水混合免疫原腹腔注射同體積的蛋白溶液。

1.2.5 間接ELISA檢測方法的建立 采用方陣滴定法，將純化后的ChTLR15(162—386 aa)蛋白分別稀釋至2.8、1.4、0.7、0.35、0.175 μg·mL-1的濃度包被酶標板，小鼠血清以1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、 1∶12 800稀釋，酶標二抗羊抗鼠IgG-HRP作1∶5 000 稀釋。其他步驟按常規(guī)ELISA程序進行[15]，以此確定最適抗原包被濃度和血清最適稀釋度。

1.2.6 細胞融合及篩選 將脾細胞和SP2/0細胞按5∶1比例進行融合，間接ELISA及間接免疫熒光進行3～4次篩選后，選擇只與重組蛋白反應(yīng)而不與載體蛋白反應(yīng)的陽性雜交瘤細胞。對效價高、生長狀態(tài)好的陽性單克隆雜交瘤細胞進行擴增。

1.2.7 單抗特異性鑒定 以Western blot法檢測4株單克隆抗體的特異性，將本實驗室保存的空載體pET-30a、免疫原ChTLR15(162—386 aa)、雞Toll樣受體21(ChTLR21)、雞磷脂酶A2-IB(ChPLA2-IB)蛋白作為待檢抗原，PBST稀釋的4株雜交瘤細胞培養(yǎng)上清作為一抗，進行Western blot反應(yīng)確定單克隆抗體的特異性。

1.2.8 單抗亞類鑒定 按照Sigma公司單克隆抗體亞類鑒定試劑盒說明書操作，鑒定單抗亞類。

1.2.9 腹水效價的測定 采用體內(nèi)誘生法制備腹水[16]，以間接ELISA法及IFA法測定腹水抗體效價。

1.2.10 抗原表位的初步定位 從雞HD11細胞中提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板，根據(jù)ChTLR15全長基因，如圖1所示，分別截取不同片段。PCR擴增片段分別命名為A(487—1 059 bp)、B(487—960 bp)、C(487—861 bp)、D(187—564 bp)、E(187—663 bp)、F(187—762 bp)、G(753—1 158 bp)。NdeI/XhoI酶切載體pET-30a，根據(jù)ClonExpress Ultra One Step CloningKit將酶切后的載體直接與PCR擴增后的目的片段進行連接。將鑒定正確的陽性質(zhì)粒參照“1.2.3”進行誘導表達。以截短表達蛋白作為抗原，以單克隆抗體2G4、6C7、6D10、7C4作為一抗，根據(jù)抗原抗體在Western blot中的結(jié)合反應(yīng)對ChTLR15抗原表位進行定位。

1.2.11 抗原表位的精確定位 以初步截短定位的結(jié)果為基礎(chǔ)，如圖2所示，將初步定位結(jié)果進行再次截短表達，最后進行Western blot分析，以確定4株單克隆抗體針對的精確抗原表位。

圖1 抗原表位初步截短定位Fig.1 Preliminary identification of antigen epitopes recognized by mAbs

圖2 抗原表位精確截短定位Fig.2 Precise identification of antigen epitopes recognized by mAbs

1.2.12 激光共聚焦顯微鏡觀察雞TLR15在HD11細胞中的定位 將HD11細胞均勻鋪于細胞板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后,棄去培養(yǎng)液。PBS洗滌，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌后用0.5% Triton-X-100透膜打孔，37 ℃靜置15 min，PBS洗滌。將6C7株陽性雜交瘤細胞上清按1∶32比例稀釋后孵育細胞，此步驟需設(shè)置空白對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h。PBS多次洗滌，而后避光加入工作濃度的Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)，37 ℃孵育1 h。用鬼筆環(huán)肽進行肌動蛋白(F-actin)染色，DAPI進行細胞核染色，PBS洗滌后拍干，封片后上機觀察。

1.2.13 免疫組化檢測ChTLR15在雞部分組織中的分布情況 將SPF雞的肝、脾、肺、腎進行預處理，而后用石蠟包埋法進行包埋。將包埋后的組織進行切片，厚度控制在5 μm左右。48 ℃烤片24 h，再經(jīng)脫蠟、潤濕、甲醇/雙氧水滅活處理制備組織切片。以6C7單抗的細胞上清(1∶500)為一抗，同時設(shè)置PBS緩沖液為對照組。山羊抗鼠HRP-IgG(1∶200)為二抗，DAB顯色液進行顯色，接著用蘇木素染料進行襯染，超純水梯度進行脫水透明，吹干后用樹膠封片，鏡下觀察分布情況。

2 結(jié) 果

2.1 表達抗原序列的分析

利用網(wǎng)站(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)預測ChTLR15線性抗原表位，如圖3所示，最終選擇第162—386 aa作為目標免疫原。

圖3 ChTLR15蛋白線性表位預測Fig.3 Linear epitope analysis of ChTLR15 protein

2.2 重組表達載體的構(gòu)建

將雙酶切后的載體pET-30a與PCR擴增的序列連接，轉(zhuǎn)化DH5α，挑取單克隆進行培養(yǎng)，以載體通用引物進行菌液PCR鑒定，如圖4所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)1條清晰的條帶，與預期大小一致。經(jīng)測序驗證，目的片段與NCBI中序列相符，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M. DL200 DNA 相對分子質(zhì)量標準；1、2. pET-30a-ChTLR15(162—386 aa)片段M. DL200 DNA marker；1, 2. The fragment of pET-30a-ChTLR15(162-386 aa)圖4 pET-30a-ChTLR15(162—386 aa)PCR鑒定結(jié)果Fig.4 Amplification of pET-30a ChTLR15(162-386 aa) fragment by PCR

2.3 重組蛋白的誘導表達

對誘導表達并超聲裂解后的全菌以及離心后的上清和沉淀進行SDS-PAGE及Western blot分析。Western blot結(jié)果如圖5A所示，重組蛋白ChTLR15以包涵體和可溶性2種形式表達。SDS-PAGE結(jié)果如圖5B所示，包涵體中的蛋白雜條帶較少且蛋白表達量較高，所以采用沉淀中的蛋白進行純化。

2.4 重組蛋白的純化

重組蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析初次純化后條帶較雜(圖6A)，凝膠過濾層析再次純化后的重組蛋白峰形單一且蛋白純度高(圖6C)，將所收集的樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，重組蛋白只出現(xiàn)1條清晰的條帶(圖6B)。

2.5 間接ELISA方法的建立

方陣試驗結(jié)果見表1，血清稀釋度為1∶6 400，抗原濃度為0.35 μg·mL-1，此時陽性血清的OD450 nm值最接近于1.0。所以，將該梯度判定為最適抗原包被濃度與最佳血清稀釋度。

2.6 小鼠的血清抗體效價

以方陣試驗建立的結(jié)果為依據(jù)，采用ELISA法對三免后的小鼠進行效價測定，同時將未免疫的小鼠血清設(shè)置為陰性對照。如圖7所示，1、2號鼠的效價均可達到1∶102 400以上，3號小鼠效價只有1∶25 600。未符合免疫要求的小鼠可繼續(xù)進行第4次免疫，直至達到要求。

A. Western blot鑒定；B. SDS-PAGE檢測；M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1. ChTLR15(162—386 aa)裂解全菌；2. ChTLR15(162—386 aa)裂解上清；3. ChTLR15(162—386 aa)裂解沉淀；4. pET-30a誘導裂解全菌A. Western blot identification; B. SDS-PAGE analysis; M. Standard molecular weight; 1. Lysed whole bacteria of ChTLR15(162-386 aa); 2. Supernatant lysates of ChTLR15(162-386 aa); 3. Precipitation lysates of ChTLR15(162-386 aa); 4. pET-30a induced lysates of the whole bacteria圖5 ChTLR15(162—386 aa)表達形式的Western blot和SDS-PAGE分析Fig.5 Western blot and SDS-PAGE analysis of the expression form of ChTLR15(162-386 aa)

A.Ni-NTA親和層析初次純化后重組蛋白的SDS-PAGE分析；B.凝膠過濾層析再次純化后重組蛋白的SDS-PAGE分析；C.凝膠過濾層析再次純化后重組蛋白的色譜分析A. SDS-PAGE analysis of the recombinant protein after initial purification by Ni-NTA affinity chromatography; B. SDS-PAGE analysis of the recombinant protein further purified by gel filtration chromatography; C. Chromatographic analysis of the recombinant protein further purified by gel filtration chromatography圖6 重組蛋白純化鑒定Fig.6 Recombinant protein purification and identification

2.7 雜交瘤細胞的克隆化

采用ELISA及IFA法對雜交瘤細胞株進行篩選，3次亞克隆后，單抗反應(yīng)性如表2所示，從中選出OD450 nm值高、熒光反應(yīng)性強、狀態(tài)良好且不與空載體反應(yīng)的陽性細胞孔。共篩選出4株能分泌抗ChTLR15(162-386 aa)蛋白的單抗細胞株，分別命名為2G4、6C7、6D10、7C4。

2.8 單克隆抗體的熒光反應(yīng)性

分別以2G4、6C7、6D10、7C4雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液與HD11細胞進行間接免疫熒光試驗。結(jié)果如圖8所示，2G4、6C7、7C4與HD11細胞有熒光反應(yīng)，而6D10與HD11細胞無熒光反應(yīng)性。其中，2G4的熒光反應(yīng)性較弱，6C7與7C4熒光反應(yīng)性較強。

表1 方陣試驗確定最適抗原包被濃度與血清稀釋度

圖7 抗體效價的測定Fig.7 Determination of serum antibody titer of immunized mice

表2 4株抗單抗的反應(yīng)性

圖8 雜交瘤細胞上清與HD11細胞的IFA反應(yīng)性(40×)Fig.8 IFA identification of mAbs reacted with HD11 cells (40×)

2.9 單抗特異性鑒定

經(jīng)Western blot鑒定，如圖9所示，雜交瘤細胞上清只與免疫原ChTLR15(162—386 aa)反應(yīng)，與其他受檢蛋白不反應(yīng)。

2.10 單抗亞類鑒定

根據(jù)單克隆抗體亞類分型試劑盒說明書對所獲得的4株單抗細胞上清進行亞類鑒定，結(jié)果(表3)表明,2G4與6C7的亞類為IgG2a，6D10與7C4的亞類為IgG1。

M.蛋白相對分子質(zhì)量標準；1. pET-30a；2. ChTLR15(162—386 aa)；3.TLR21；4.PLA2-IBM. Standard molecular weight of protein；1. pET-30a; 2. ChTLR15(162-386 aa); 3. TLR21; 4. PLA2-IB圖9 單抗反應(yīng)性鑒定Fig.9 Reactivity identification of mAbs by Western blot

表3 4株單抗的亞類

2.11 腹水的效價

將最終獲得的4株穩(wěn)定分泌針對ChTLR15蛋白的單克隆抗體，用間接ELISA法及IFA法檢測腹水效價，結(jié)果如表4所示，6C7、6D10腹水ELISA效價分別為1∶20 480、1∶40 960；2G4、7C4無腹水ELISA效價。2G4、6C7、7C4腹水IFA效價分別為1∶80、1∶2 560、1∶5 120，6D10無腹水IFA效價。

表4 雜交瘤細胞上清的抗體效價

2.12 抗原表位的鑒定

截短ChTLR15(162—386 aa)蛋白與4株單抗作Western blot分析，結(jié)果如圖10所示，2G4與7C4識別的抗原表位為230QLGTVLEF237，6C7與6D10識別的抗原表位為245EMDLLS250。

圖10 2G4、6C7、6D10、7C4識別的抗原表位Fig.10 Antigen epitopes recognized by MAbs 2G4, 6C7, 6D10, 7C4

2.13 激光共聚焦顯微鏡觀察ChTLR15亞細胞定位

藍色(DAPI)表示細胞核，紅色(鬼筆環(huán)肽)表示細胞骨架肌動蛋白，綠色[Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)]表示ChTLR15，NC表示陰性對照。激光共聚焦顯微技術(shù)3D立體圖(圖11)顯示，ChTLR15位于細胞表面。

2.14 雞TLR15在SPF雞部分組織中分布

取SPF雞肝、脾、肺、腎，經(jīng)免疫組織化學檢測，結(jié)果顯示(圖12)，PBS對照組無陽性信號，健康組有微弱的陽性染色，攻毒組有較明顯的陽性染色，陽性染色細胞呈黃褐色。其中,肝染色最深，腎和肺染色次之，脾中少數(shù)陽性染色細胞呈淺黃色。

圖11 激光共聚焦檢測ChTLR15蛋白亞細胞定位(標尺=10 μm)Fig.11 The subcellular localization of ChTLR15 protein detected by laser confocal microscope (bar=10 μm)

A.肝；B.脾；C.肺；D.腎；1. PBS對照組；2. 健康組；3. APEC E516攻毒組A. Liver; B. Spleen; C. Lung; D. Kidney; 1. PBS control group; 2. Healthy group; 3. APEC E516 challenge group圖12 ChTLR15的免疫組織化學檢測(40×)Fig.12 Detection of ChTLR15 in tissues from both mock and APEC challenged birds by immunohistochemistry (40×)

3 討 論

ChTLR15最先由Higgs鑒定出來，在雞脾、法氏囊和骨髓中表達，且可能與宿主防御有關(guān)[11]。關(guān)于ChTLR15在家禽免疫相關(guān)細胞和組織中的表達情況以及其與家禽抵抗病原微生物感染能力的關(guān)系是最近研究的焦點。TLR15主要通過其胞外區(qū)識別病原微生物的PAMPS而發(fā)揮作用，故本研究選用了部分胞外區(qū)基因片段進行原核表達，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-30a-ChTLR15(162—386 aa)。Western blot鑒定重組蛋白以可溶性、包涵體兩種形式表達，但包涵體表達的蛋白雜條帶少且表達量高，故選用包涵體制備目的蛋白。采用尿素梯度透析法進行變復性，并利用凝膠過濾層析法進行蛋白純化，獲得了純度較高的重組蛋白，進行動物免疫、細胞融合與亞克隆。

單克隆抗體只針某一特定抗原表位，具備純度高、特異性好的優(yōu)點[17-19]，抗原純度、合適的免疫方案是影響單克隆抗體質(zhì)量的重要因素[20]。迄今，除邢波建等[21]制備出ChTLR15多克隆抗體外，未見有ChTLR15單克隆抗體的報道。本研究為了獲得ELISA反應(yīng)性、熒光反應(yīng)性的單抗，以IFA加ELISA“雙指標”進行篩選，共篩選出4株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為2G4、6C7、6D10、7C4。2G4、6C7、7C4與雞巨噬細胞系HD11具有不同強度的熒光反應(yīng)；6D10則不具備與該細胞系的熒光反應(yīng)性，推測可能是原核表達系統(tǒng)缺少糖基化、磷酸化和高級修飾，使得翻譯加工后的蛋白不能正常折疊[22]，而上述雞傳代細胞系中天然TLR15蛋白具有類似其在雞體內(nèi)的構(gòu)象表位，具體原因還需進一步分析[23]，熒光的強弱和ELISA值的高低，可能與抗體的結(jié)合能力有關(guān)[24]。以上4種單抗不同的熒光和ELISA反應(yīng)性再次證明，確有必要同步采取這兩種方法進行篩選，才能得到具有不同反應(yīng)性的單抗。

抗原表位又稱抗原決定簇，為可與抗體或B/T細胞抗原受體特異性結(jié)合的化學基團，可以由蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)或三級結(jié)構(gòu)組成，是機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)[25]。為了確定制備的單抗所針對的抗原表位，對ChTLR15基因進行多次截短表達，最終確定單抗2G4與7C4識別的抗原表位為230QLGTVLEF237，6C7與6D10識別的抗原表位為245EMDLLS250。

de Zoete等[26]用標記的TLR15轉(zhuǎn)染HeLa 57A和雞DF-1細胞，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TLR15與細胞表面標記麥胚凝集素共定位，認為TLR15是一種定位于細胞表面的糖蛋白。本文以HD11細胞為材料，對細胞核、肌動蛋白進行染色，以具熒光反應(yīng)性的單抗6C7為一抗，Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L)為二抗，通過激光共聚焦掃描形成3D立體圖，直觀地展現(xiàn)ChTLR15蛋白位于細胞表面，與de Zoete等[26]的研究結(jié)果一致。

孫鈺等[27]使用鼠傷寒沙門菌誘導雞盲腸和脾臟中TLRs的表達，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測表達情況，發(fā)現(xiàn)TLR2、4、5、15、21的mRNA表達量在盲腸和脾均顯著上升。Abasht等[28]發(fā)現(xiàn)雞感染沙門菌后，其脾中TLR2、TLR15 mRNA表達量增加。王燕等[29]以白痢沙門菌感染雛雞，發(fā)現(xiàn)ChTLR15 mRNA表達量也呈增加趨勢。綜上所述，雞ChTLR15在細菌感染后的表達量往往上調(diào)。本研究采用免疫組化技術(shù)檢測TLR15在雞部分臟器中的分布，TLR15在SPF雞肝、脾、肺和腎中均有表達，但表達量較少；O1血清型APEC感染的SPF雞中肝、脾、肺和腎的TLR15表達量均有增加，也印證了上述研究的結(jié)論。

4 結(jié) 論

成功制備出4株抗ChTLR15的單克隆抗體，并對其抗原表位進行了鑒定；確定了TLR15在部分臟器中的分布及其在HD11細胞中的定位，為其后續(xù)ChTLR15的生物學功能以及禽類TLRs相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)機制研究提供了有力工具。