放療聯(lián)合缺氧誘導(dǎo)因子-1抑制劑對(duì)荷乳腺癌小鼠治療的作用

劉凱　王紅梅

摘要：本文探討了放療聯(lián)合缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）抑制劑對(duì)荷乳腺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響，構(gòu)建了BALB/C小鼠4T1乳腺癌模型，隨機(jī)分為4組，每組4只，分別為對(duì)照組、放療組、HIF-1抑制劑組（因使用HIF-1抑制劑為PX478，以下稱PX478組）、放療聯(lián)合PX478治療組（以下稱聯(lián)合組），監(jiān)測(cè)4組小鼠腫瘤生長(zhǎng)的情況并繪制生長(zhǎng)曲線。荷乳腺癌小鼠于25天后，無(wú)菌取腫瘤組織、淋巴結(jié)及脾臟，觀察免疫印跡分析HIF-1α和MMP-2蛋白含量的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組腫瘤生長(zhǎng)明顯縮小，腫瘤組織的HIF-1α和MMP-2蛋白含量最少。由此可以看出，放療聯(lián)合缺氧誘導(dǎo)因子-1抑制劑可抑制荷乳腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：放射治療? ?缺氧誘導(dǎo)因子? ?腫瘤

腫瘤已成為威脅人類死亡的重要原因，腫瘤的治療方法成為各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。免疫系統(tǒng)既可以引起機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)，又可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形成免疫耐受。免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著雙重作用，可分為三個(gè)主要階段：免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸。放療可以治療腫瘤，臨床上出現(xiàn)了一種有趣的現(xiàn)象，在腫瘤局部放療時(shí)，放射野外遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶也出現(xiàn)了縮小，即“遠(yuǎn)位效應(yīng)”。研究表明，這一現(xiàn)象是由放療激活機(jī)體免疫應(yīng)答引起的。放療聯(lián)合免疫治療顯著優(yōu)于任何單一療法，但對(duì)于放療促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。隨著腫瘤的日益長(zhǎng)大，組織缺氧也會(huì)變得越發(fā)嚴(yán)重，缺氧改變了腫瘤微環(huán)境，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用，缺氧還改變了腫瘤微環(huán)境中重要的免疫因子。下面，筆者將著重探討放療聯(lián)合HIF-1抑制劑PX478對(duì)荷乳腺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響。

一、實(shí)驗(yàn)方法

1.4T1乳腺癌小鼠建模

取將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1乳腺癌細(xì)胞注入BALB/C小鼠背部接近后肢處[1ml注射器注射0.1ml（含2×105細(xì)胞）細(xì)胞懸液]。

2.治療方法

每日觀察荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)

情況，按照體積= ×長(zhǎng)徑×短徑2

計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，待腫瘤體積≥150-300mm3后（大約7-12天）進(jìn)行下一步治療。隨機(jī)將荷瘤小鼠分為4組（對(duì)照組、放療組、PX478組、聯(lián)合組），每組4只，每天給予PX478組和聯(lián)合組200ul PX478灌胃，對(duì)照組和放療組給予200ul PBS灌胃。第13天，對(duì)放療組和聯(lián)合組荷瘤小鼠進(jìn)行10Gy的電離輻射放療后，繼續(xù)進(jìn)行灌胃治療，并監(jiān)測(cè)腫瘤大小。

3.取腫瘤組織、脾臟和淋巴結(jié)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

荷瘤25天，脫頸椎法處死荷瘤小鼠，無(wú)菌下收集腫瘤組織，置電子天平稱重，收集脾臟、淋巴結(jié)放于5ml培養(yǎng)皿中。

4.腫瘤組織HIF-1α、MMP-2蛋白表達(dá)量測(cè)定

提取腫瘤組織蛋白，BCA法蛋白濃度測(cè)定，SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫印跡及曝光。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）顯示，兩組以上數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果值均以P<0.05作為差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.腫瘤生長(zhǎng)

每日觀察腫瘤的變化并記錄生長(zhǎng)情況，用體積公式計(jì)算出腫瘤大小，并繪制出腫瘤生長(zhǎng)曲線，接瘤7天后，腫瘤生長(zhǎng)至150-300 mm3，分別給予PX478和聯(lián)合組灌胃治療，第13天給予放療和聯(lián)合組10Gy放射治療后，繼續(xù)進(jìn)行灌胃治療并監(jiān)測(cè)腫瘤大小。

如圖1中A所示每日記錄腫瘤體積，實(shí)驗(yàn)期間計(jì)算每組腫瘤體積平均值，其中，放療組與PX478組腫瘤平均體積無(wú)明顯差異（P=0.1894），而聯(lián)合組與其余三組腫瘤平均體積的差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1中B為荷瘤第25天處死小鼠后剝離腫瘤的情況，可以直觀地看出放療組、PX478組、聯(lián)合組的腫瘤生長(zhǎng)明顯小于對(duì)照組。

圖1中C為剝離的腫瘤測(cè)重，聯(lián)合組與放療組、PX48組腫瘤重量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而且聯(lián)合組與對(duì)照組腫瘤重量的差異則有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。以上結(jié)果提示放療聯(lián)合PX478治療可以顯著地抑制荷乳腺癌小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。

2.PX478對(duì)腫瘤組織中HIF-1α、MMP-2蛋白表達(dá)影響

我們用Western Blot法檢測(cè)使用PX478和放療后腫瘤組織中HIF-1α、MMP-2表達(dá)的情況，如圖2所示。結(jié)果顯示，聯(lián)合組與PX478組的HIF-1α蛋白水平無(wú)明顯差異（P=0.1791），聯(lián)合組與放療組的HIF-1α蛋白水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而且聯(lián)合組與對(duì)照組的HIF-1α蛋白水平的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。由此可見(jiàn)，PX478聯(lián)合放療可以導(dǎo)致腫瘤的HIF-1α蛋白水平降低，從而引起的MMP-2蛋白也出現(xiàn)低表達(dá)的情況。

三、討論

放療成為腫瘤治療的重要方法之一，1895年11月，倫琴首次發(fā)現(xiàn)了X射線。1896年1月，格魯比就用X射線治療了第一例乳腺癌的患者，已有100多年的歷史。研究人員發(fā)現(xiàn)放療不同劑量，分割模式對(duì)不同腫瘤的治療效果也不一樣。放療通過(guò)促進(jìn)HMGB-1釋放，再刺激抗原呈遞細(xì)胞（APC）活化和成熟，促使T細(xì)胞的活化，使腫瘤容易被機(jī)體免疫識(shí)別而被清除。

腫瘤生長(zhǎng)需要大量營(yíng)養(yǎng)，組織缺氧是很多分子信號(hào)通路的潛在驅(qū)動(dòng)子，這些驅(qū)動(dòng)子使腫瘤細(xì)胞得以存活，并在微環(huán)境中生長(zhǎng)，使得腫瘤細(xì)胞放射敏感度降低?？死说膱F(tuán)隊(duì)于2014年證實(shí)在通過(guò)高氧預(yù)處理多形性成神經(jīng)膠質(zhì)瘤后放療效果更好。張玉春的團(tuán)隊(duì)通過(guò)較低劑量的照射，抑制低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）等mRNA的表達(dá)，改善裸小鼠荷SKOV-3卵巢瘤的缺氧狀況，提高放射敏感性。利用PX478抑制小鼠體內(nèi)缺氧的微環(huán)境，提高放療的敏感度能否提高腫瘤的治療效果是一個(gè)值得嘗試的課題。

四、結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠4T1乳腺癌模型，用放療聯(lián)合PX478可以促進(jìn)小鼠機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制腫瘤生長(zhǎng)。與此同時(shí)，探索放療的最佳劑量及分割模式以及聯(lián)合最優(yōu)劑量的免疫抑制劑對(duì)不同腫瘤的治療效果是一項(xiàng)煩瑣而富有挑戰(zhàn)性的工作。

參考文獻(xiàn)：

[1]胥蕓蕓，洪梅，李桂香.放療對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)機(jī)制的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2016（24）.

（作者單位：劉凱? 南昌市衛(wèi)生學(xué)校;王紅梅? 南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）