參草通脈顆粒對(duì)慢性心衰大鼠Wnt通路抑制因子表達(dá)的影響

劉曉蕾　張艷

【摘要】 目的 探討參草通脈顆粒治療慢性心力衰竭（CHF）的療效機(jī)制。方法 80只SPF級(jí)SD雄性大鼠應(yīng)用冠脈結(jié)扎法， 采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）方法， 隨機(jī)選取10只為正常組， 造CHF大鼠模型后剩余59只大鼠隨機(jī)分為模型組（19只）， 參草通絡(luò)顆粒組（20只）， 賴諾普利組（20只），?測(cè)定大鼠血清中Dickkopf-1（DKK1）、分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（sFRP1）和Wnt抑制因子-1（WIF1）水平。

結(jié)果 模型組的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平分別為（3.48±0.82）、（191.56±3.78）、（55.16±0.94）μg/L均高于正常組的（1.59±0.08）、（86.84±4.02）、（22.58±0.95）μg/L、賴諾普利組的（2.87±0.27）、（169.75±2.89）、（46.41±2.12）μg/L及參草通脈顆粒組的（2.25±0.09）、（126.36±6.37）、（36.18±2.06）μg/L;且賴諾普利組的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平均高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)論 參草通脈顆粒通過調(diào)控Wnt通路抑制劑， 可以有效發(fā)揮治療CHF的作用。

【關(guān)鍵詞】 慢性心力衰竭;參草通脈顆粒;分泌性卷曲相關(guān)蛋白-1;Wnt抑制因子-1;Dickkopf-1

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.28.093

CHF是多種心臟疾病的終末期表現(xiàn)。Wnt信號(hào)通路是近年來研究的熱點(diǎn)， 在CHF發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路抑制因子可阻斷Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)， 對(duì)心臟具有保護(hù)作用[1， 2]。參草通脈顆粒是臨床應(yīng)用30余年治療CHF的經(jīng)驗(yàn)方， 通過多年的臨床觀察和試驗(yàn)， 參草通脈顆粒對(duì)CHF患者療效確切[3]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)Wnt傳導(dǎo)通路抑制因子DKK1、sFRP1、WIF1， 探討參草通脈顆粒治療CHF的療效機(jī)制， 現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取15周齡， 80只SPF級(jí)SD雄性大鼠， 體重為250～300 g， 由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1. 2 藥物制備 參草通脈顆粒（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字Z20055492）組成：丹參、人參、黃芪、紅花、三七粉、益母草、茯苓、葶藶子處方中的全部藥材均符合參照國(guó)家藥典2010版有關(guān)規(guī)定。賴諾普利片（國(guó)藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司， 國(guó)藥準(zhǔn)字H20065768）。

1. 3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 DKK1、sFRP1、WIF1蛋白測(cè)定的ELISA試劑盒， 低溫高速離心機(jī)， 酶標(biāo)儀等。

1. 4 CHF大鼠動(dòng)物模型制備 大鼠正常條件下適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后， 為全部動(dòng)物編號(hào)后隨機(jī)抽取10只為正常組。其余大鼠禁食不禁水12 h后， 腹腔麻醉， 氣管插管， 設(shè)置呼吸機(jī)參數(shù)（潮氣量：0.7 ml/kg， 頻率：80次/min），?消毒后在左側(cè)第3、4肋間橫向切開長(zhǎng)約1～2 cm， 逐層分離， 暴露視野可見心臟， 用縫合線結(jié)扎距離左冠脈前降支起始點(diǎn)2～3 mm處， 心電圖提示胸導(dǎo)ST段和T波出現(xiàn)明顯異常， 說明結(jié)扎成功， 將心臟送回胸腔， 用注射用青霉素鈉（哈藥集團(tuán)制藥總廠， 國(guó)藥準(zhǔn)字H23021439）手術(shù)切口處敷用， 大鼠生命體征平穩(wěn)后， 撤掉呼吸機(jī)。預(yù)防術(shù)后感染， 連續(xù)3 d應(yīng)用注射青霉素鈉30萬IU， 1次/d。正常飼養(yǎng)1周后， 喂養(yǎng)飼料減少1/2;同時(shí)大鼠進(jìn)行力竭式游泳1次/d， 連續(xù)4周。經(jīng)超聲檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）≤60%， 可以判定為心力衰竭， 同時(shí)列入觀察對(duì)象[4]。

1. 5 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 大鼠在造模前、后共死亡11只， 將剩余59只大鼠， 按照隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組（19只）、參草通脈顆粒組（20只）、賴諾普利組（20只）， 空白對(duì)照組為正常喂養(yǎng)未手術(shù)造模的大鼠?？瞻讓?duì)照組和模型組大鼠不用藥， 灌胃生理鹽水10 ml/kg， 1次/d。其余組大鼠用藥劑量， 按人鼠劑量換算公式， 劑量（g/kg）=藥品劑量（人口服）（g）×0.018/動(dòng)物體重（kg）[5]，?計(jì)算出賴諾普利組服用生藥劑量為1.5 mg/（kg·d）， 參草通脈顆粒組服用生藥劑量為9.2 g/（kg·d）， 兩組藥溶于3 ml蒸餾水1次/d灌胃， 各組連續(xù)給藥42 d。

1. 6 實(shí)驗(yàn)取材 大鼠麻醉、處死， 腹主動(dòng)脈取血， 離心， 收集上清液， 分裝后低溫保存， 用于檢測(cè)DKK1、sFRP1、WIF1蛋白濃度。

1. 7 方法 采用ELISA法， 測(cè)定比較各組大鼠血清DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平。按照試劑盒說明及儀器要求的操作步驟進(jìn)行。

1. 8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 各組大鼠血清DKK1蛋白水平比較 模型組的DKK1蛋白水平高于正常組、賴諾普利組及參草通脈顆粒組;賴諾普利組的DKK1蛋白水平高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 各組大鼠血清sFRP1蛋白水平比較 模型組的sFRP1蛋白水平高于正常組、賴諾普利組及參草通脈顆粒組;賴諾普利組的sFRP1蛋白水平高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2. 3 各組大鼠血清WIF1蛋白水平比較 模型組的WIF1蛋白水平高于正常組、賴諾普利組及參草通脈顆粒組;賴諾普利組的WIF1蛋白水平高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3 討論

在CHF發(fā)病機(jī)制過程中Wnt信號(hào)通路是近年一直研究的熱點(diǎn)， Wnt信號(hào)通路主要由Wnt蛋白、細(xì)胞膜受體、胞漿內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)部分和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控部分組成， 分為經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt通路[6]。研究發(fā)現(xiàn)[7， 8]， CHF發(fā)生過程中， 在經(jīng)典通路， Wnt蛋白與受體LRP5/6和FZD結(jié)合， 激活Wnt-β-catenin信號(hào)通路， 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。非經(jīng)典通路， Wnt蛋白與受體FZD結(jié)合， 激活Wnt/Ca2+和Wnt/PCP/JNK信號(hào)通路， 促進(jìn)心肌肥厚的發(fā)生[9]。DKK1、sFRP1、WIF1是Wnt信號(hào)通路抑制劑， 通過不同途徑影響Wnt配體-受體的結(jié)合， 調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。DKK1可以抑制Wnt蛋白配體與受體LRP5/6結(jié)合， 阻斷Wnt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。而sFRP1和WIF1先與Wnt蛋白結(jié)合， 阻止Wnt蛋白與FZD受體結(jié)合， 亦阻斷Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)[12]。因此DKK1、sFRP1、WIF1通過阻斷Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)， 可延遲CHF的發(fā)生和發(fā)展， 對(duì)心臟具有保護(hù)作用。

參草通脈顆粒是多年臨床治療CHF的經(jīng)驗(yàn)方， 作者團(tuán)隊(duì)前期對(duì)280例CHF患者臨床試驗(yàn)研究， 結(jié)果證明參草通脈顆?？擅黠@改善患者心功能分級(jí)， 提高LVEF水平[12]。該藥物由黃芪、人參、紅花、丹參、益母草、三七粉、葶藶子、茯苓組成。藥理學(xué)研究表明[13]， 黃芪對(duì)心肌活性亦有保護(hù)作用， 它已用于CHF的治療， 黃芪甲苷是正性肌力作用的主要活性成分， 對(duì)心力衰竭患者具有改善心肌舒縮功能、排鈉利尿、抑制心肌重構(gòu)、改善心肌能量代謝、抑制心肌細(xì)胞凋亡、抑制氧化應(yīng)激、抑制纖維化等多種作用。人參治療CHF過程中， 人參皂苷成分起主要作用， 研究表明[14]， 人參皂苷也可降低心力衰竭大鼠心肌膠原含量， 抑制心肌纖維化改善心室舒、縮功能。紅花的有效成分紅花黃色素， 具有興奮心臟作用， 使心跳有力， 振幅加大， 增加冠狀動(dòng)脈血流量和降低冠狀動(dòng)脈阻力， 改善心肌缺血[15]。丹參有效成分為丹參酮Ⅱ， 通過影響心肌細(xì)胞Ca2+內(nèi)流， 阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)， 抑制心室肥厚[16]。益母草中鹽酸水蘇堿成分能降低心臟指數(shù)、左心室指數(shù)和心肌細(xì)胞橫截面積， 還能夠抑制肥厚心肌組織心房肽（ANP）和腦鈉素（BNP）的表達(dá)， 對(duì)心肌肥厚具有一定的抑制作用[17]。三七的有效成分是三七總皂苷， 三七總皂苷可以顯著提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性， 改善離子轉(zhuǎn)運(yùn)， 抑制心肌間質(zhì)細(xì)胞膠原增生， 抑制心肌肥厚[18]。葶藶子具有顯著的利尿作用， 增加心臟輸出量減輕心臟負(fù)荷， 同時(shí)葶藶子能抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的過度激活， 防止心室重構(gòu)[19]。茯苓素作為茯苓的主要活性成分， 是新的醛固酮受體拮抗劑， 體外可競(jìng)爭(zhēng)醛固酮受體， 體內(nèi)逆轉(zhuǎn)醛固酮效應(yīng)， 具有利尿消腫的作用[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 模型組的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平高于正常組、賴諾普利組及參草通脈顆粒組;賴諾普利組的DKK1、sFRP1、WIF1蛋白水平高于參草通脈顆粒組， 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。提示是機(jī)體應(yīng)對(duì)心臟結(jié)構(gòu)改變和CHF發(fā)生的一種負(fù)反饋現(xiàn)象。經(jīng)藥物干預(yù)后， 參草通脈顆粒效果較優(yōu)。

綜上所述， 參草通脈顆粒對(duì)Wnt信號(hào)通路抑制劑的表達(dá)水平有明顯調(diào)控作用， 闡明了參草通脈顆粒治療CHF作用機(jī)制， 為CHF患者的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。

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[收稿日期：2020-05-06]