基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討牛膝治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的有效物質(zhì)與作用機制研究

潘莉　郭斌　唐徐韻　尚雪梅　胡蔚婧　楊孝芳

【摘 要】 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學和生物系信息學方法篩選中藥牛膝治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的主要成分、作用靶點和作用機制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺獲取牛膝化學成分，根據(jù)口服藥物生物利用度和類藥性分別篩選其有效活性成分并預(yù)測其作用靶點;通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索膝骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)基因，應(yīng)用VENNY 2.1.0構(gòu)建牛膝治療膝骨性關(guān)節(jié)炎靶點;應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò);通過SPRING構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖并進行核心網(wǎng)絡(luò)可視化展示;將藥物-疾病關(guān)鍵靶點蛋白進行GO功能和KEGG 通路富集分析。結(jié)果：槲皮素、山奈酚、黃芩素是牛膝治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵化合物，IL-6、IL-1β、JUN、CXCL8、CCL2、IL-10是牛膝治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵靶點，GO富集分析顯示牛膝治療膝骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵靶點涉及生物過程條目有1080條，細胞組成條目有8條，分子功能條目有36條，KEGG通路分析顯示AGEs-RAGE、IL-17、TNF是牛膝治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的主要機制通路。結(jié)論：牛膝可以通過多成分、多靶點、多通路機制協(xié)同治療膝骨性關(guān)節(jié)炎。

【關(guān)鍵詞】 網(wǎng)絡(luò)藥理學;牛膝;膝骨性關(guān)節(jié)炎;物質(zhì)基礎(chǔ);作用機制

【中圖分類號】R285.6?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）18-0038-08

Study on the Effective Substances and Mechanism of Achyranthes Bidentata in the

Treatment of Knee Osteoarthritis Based on Network Pharmacology

PAN Li GUO Bin TANG Xuyun SHANG Xuemei HU Weijing YANG Xiaofang*

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China

Abstract：Objective Screening the main components， targets， and mechanisms of traditional Chinese medicine Achyranthes bidentata for the treatment of knee osteoarthritis using network pharmacology and bioinformatics. Methods Collect the chemical constituents of Achyranthes bidentata through the Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）， screen the effective active ingredients and predict their targets based on the oral drug bioavailability and drug-like properties; Collect genes related to knee osteoarthritis through GeneCards and OMIM databases; Use VENNY 2.1.0 to construct Achyranthes bidentata for the treatment of KOA targets; Use Cytoscape 3.7.1 software to build a drug-molecule-target-disease regulation network; Construct a PPI network diagram through SPRING and visualize the core network; The drug-disease target protein was analyzed for GO function and KEGG pathway enrichment. Result Quercetin， kaempferol， and baicalein are the key compounds for Achyranthes bidentata to treat KOA， IL-6， IL-1β， JUN， CXCL8， CCL2， IL-10 are the key targets for Achyranthes bidentata to treat KOA， GO enrichment analysis shows that there are 1080 entries of biological processes， 8 cell composition items and 36 molecular function entries related to the key targets of Achyranthes bidentata to treat KOA. Conclusion Achyranthes bidentata can treat KOA through multiple components， multiple targets， and multiple pathway.

Keywords：Internet Pharmacology; Achyranthes Bidentata; Knee Osteoarthritis; Material Basis; Mechanism of Action

膝骨性關(guān)節(jié)炎（Knee osteoarthritis， KOA）是以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的一種慢性關(guān)節(jié)病[1]，臨床表現(xiàn)主要以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形和功能障礙為主，不僅損害關(guān)節(jié)軟骨，還累及整個關(guān)節(jié)，是中老年人的常見病、多發(fā)病[2-3]。該病發(fā)病率高，患病人數(shù)逐年增多，西藥起效快，但具有明顯的胃腸道副反應(yīng)，不適宜長期應(yīng)用，只可短期對癥治療[4]。近些年中醫(yī)藥在治療骨關(guān)節(jié)疾病和自身免疫性疾病中展現(xiàn)出了良好的療效[5-6]，因此中藥候選藥物備受期待和矚目。

牛膝是臨床治療骨關(guān)節(jié)類疾病常用中藥，屬于莧科植物牛膝Achyranthes bidentate BI的根，具有補肝腎、強筋骨、活血通絡(luò)等功效[7]。藥理學研究表明[8-11]，牛膝具有抗炎、抗骨質(zhì)疏松、免疫調(diào)節(jié)、軟骨修復(fù)等多方面作用，但其治療KOA的主要物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制尚不清楚。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學和生物信息學方法，從分子水平上闡明牛膝治療KOA的有效成分、作用靶點和關(guān)鍵機制通路，為后期的基礎(chǔ)研究、新藥開發(fā)和臨床研究提供一定的參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 牛膝所含化合物的檢索與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）在“Herb name”選項中輸入牛膝，對牛膝所有化合物進行檢索，根據(jù)藥物動力學和成藥原則，設(shè)定口服生物利用度（Oral bioavailability， OB）≥30%和類藥性指數(shù)（Drug-like index， DL）≥0.18為篩選條件進行篩選。

1.2 牛膝所含化合物作用靶點預(yù)測 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中的Related Targets收集牛膝所含化合物作用的靶點并進行整理，通過Perl軟件篩選有效化合物靶點基因，將所得的基因用Uniprot數(shù)據(jù)庫進行篩選和映射得到對應(yīng)的標準基因名。

1.3 KOA疾病靶點及牛膝作用于KOA的靶點預(yù)測 通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫以“knee osteoarthritis”為關(guān)鍵詞進行檢索，收集 KOA疾病相關(guān)靶點，為增強疾病與靶點的相關(guān)性，將GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索出的靶基因按Relevance score≥10進行整理，并與OMIM數(shù)據(jù)庫所得的靶基因進行合并、去重。將牛膝所對應(yīng)的有效化合物預(yù)測的靶點與KOA疾病靶點導(dǎo)入VENNY 2.1 軟件，獲取牛膝作用于KOA的交集靶點。

1.4 構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò) 將預(yù)測得到的牛膝有效成分和 KOA效應(yīng)靶點等信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件進行藥物-成分-靶點-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖繪制，應(yīng)用Cytoscape-Tool-Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度和介數(shù)中心度，尋找牛膝治療KOA關(guān)鍵化合物和靶點。

1.5 牛膝對KOA作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將獲得的牛膝作用于KOA的靶點上傳至在線 STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”（人類），設(shè)置靶點間最低要求互動得分為0.9并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點，獲取相應(yīng)的蛋白相互作用圖，并根據(jù)結(jié)果對靶點蛋白進行分析。

1.6 牛膝治療KOA的GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對潛在效應(yīng)靶點蛋白進行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。GO功能富集分析選擇生物過程（biological process）、細胞組成（cellular component）和分子功能（molecular function）3個部分前10條進行繪圖，KEGG篩選前20個條目進行氣泡圖繪制。

2 結(jié)果

2.1 牛膝所含化合物篩選結(jié)果 經(jīng)TCMSP共檢索到牛膝含有化合物176個，根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18篩選后，得到有效活性成分20個。見表1。

2.2 牛膝有效化合物作用靶點預(yù)測結(jié)果 將篩選出的20個牛膝有效化合物靶點進行整理，通過perl軟件篩選有效化合物靶點基因，將所得的基因用Uniprot數(shù)據(jù)庫進行篩選和映射得到363個對應(yīng)的標準基因名。

2.3 KOA疾病靶點及牛膝作用于KOA的靶點預(yù)測結(jié)果 通過GeneCards檢索收集 KOA疾病相關(guān)的靶點1878個，篩選Relevance score≥10分的靶點，篩選后剩余靶點201個;OMIM數(shù)據(jù)庫所得靶點28個，匯總后去除重復(fù)共得到KOA相關(guān)疾病靶基因223個。將牛膝經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫進行篩選和映射得到363個靶點與KOA收集到的223個疾病靶基因?qū)隫ENNY 2.1 軟件，共得到29個共同靶點（見圖1、表2）。

2.4 藥物-成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果 應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件將預(yù)測得到的牛膝有效成分、作用靶點和KOA疾病靶點進行藥物-成分-靶點-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖繪制（如圖2所示），并用Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度和介數(shù)中心度，得出化合物槲皮素（quercetin，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度=28，介數(shù)中心度=0.3187），漢黃芩素（wogonin，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度=12，介數(shù)中心度=0.0591），山奈酚（kaempferol，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度=10，介數(shù)中心度=0.0377），黃芩素（baicalein，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度=5，介數(shù)中心度=0.0098）為牛膝治療KOA主要化合物;靶點前列腺素G/H合成酶2（PTGS2，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度=12，介數(shù)中心度=0.1056），前列腺素G/H合成酶1（PTGS1，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度=11，介數(shù)中心度=0.0883），一氧化氮合酶2（NOS2，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度=7，介數(shù)中心度=0.0297），雌激素受體1（ESR1，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度=7，介數(shù)中心度=0.0308），為主要相互作用靶點。

2.5 牛膝對KOA作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 將獲得牛膝作用于KOA的29個靶點基因上傳至在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”（人類），設(shè)置靶點間最低要求互動得分為0.9并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點，獲取相應(yīng)的蛋白相互作用圖如圖3所示，根據(jù)Count值篩選列舉牛膝治療KOA排名前20的關(guān)鍵靶點結(jié)果如圖4所示。

2.6 牛膝治療KOA的GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析結(jié)果 應(yīng)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對潛在效應(yīng)靶點蛋白進行基因本體論（Gene Ontology， GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路富集分析。GO功能富集分析得出生物過程條目有1080條，細胞組成條目有8條，分子功能條目有36條，取每個部分排名前10的條目進行繪圖、分析，不足10條的按實際富集信息展示，結(jié)果如圖5所示。在生物過程分析中排名靠前的主要有細胞外基質(zhì)、細胞外結(jié)構(gòu)、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、急性期反應(yīng)等;在細胞組成分析中排名靠前的主要有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、含膠原的細胞外基質(zhì)、纖維狀膠原三聚體、帶狀膠原纖維、膠原三聚體復(fù)合物等;在分子功能分析中排名靠前的主要有細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、整聯(lián)蛋白結(jié)合、生長因子受體結(jié)合等。KEGG通路富集分析取前20條通路制作氣泡圖如圖6所示。結(jié)果顯示，晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（AGEs-RAGE）、白介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子（TNF）、松弛素（Relaxin）、C-型凝集素（C-type Lectins） 、Toll樣受體（TLR）等信號通路是牛膝治療KOA主要靶點富集的通路。

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，痹癥主要是由素體不足，正氣偏虛，勞逸過度，腠理不密，衛(wèi)外不固，外邪入侵，飲食失調(diào)等所造成，其反復(fù)發(fā)作可使津血運行不暢，氣滯血瘀，久則損傷肝腎，造成肝腎虧虛，由此波及其他臟腑。所以活血化瘀和補益肝腎在痹癥的治療中顯得尤為重要，而牛膝的主要功效為補肝腎，強筋骨，逐瘀通經(jīng)。牛膝在很多名方、驗方和名老中醫(yī)治療骨關(guān)節(jié)疾病中都有體現(xiàn)[12]，雖然取得了很好的療效，但其具體分子機制方面的研究相對較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素（quercetin），山奈酚（kaempferol），黃芩素（baicalein）為牛膝治療KOA主要化合物。Bing Wei等[13]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以通過減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制軟骨細胞外基質(zhì)的降解來改善骨關(guān)節(jié)的變性。山奈酚可以促進MC3T3-E1細胞中miR-101的上調(diào)和Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而影響成骨細胞的增殖、遷移和分化[14]。黃芩素在體外和體內(nèi)均能夠顯著降低與軟骨炎癥反應(yīng)發(fā)生密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達。此外，黃芩素還能減輕前交叉韌帶橫斷誘發(fā)的家兔KOA模型的軟骨損傷[15]。研究表明，KOA中局部炎癥因子的釋放與疼痛、腫脹和軟骨分解相關(guān)[16]。此外，KOA還會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，而大量的氧自由基又會導(dǎo)致長期炎癥的病理發(fā)生和發(fā)展[17]。從牛膝中的主要有效成分槲皮素、山奈酚、黃芩素的藥理作用可以看出其在抗炎、抗氧化、減輕骨損傷等發(fā)面發(fā)揮著良好的作用[18-20]，故牛膝可被認為是治療KOA的有效候選藥物。

從牛膝對KOA作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)及核心蛋白篩選的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1β、JUN、CXCL8、CCL2、IL-10是牛膝作用于KOA的關(guān)鍵靶點。有研究顯示[21-23]，IL-1β和IL-6是在關(guān)節(jié)軟骨破壞和浸潤過程中起主要作用的炎性細胞因子。趨化因子是骨關(guān)節(jié)疾病中關(guān)節(jié)組織代謝被破壞的介質(zhì)[24]，CCL2的升高可以反映骨/軟骨代謝的改變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞、介導(dǎo)KOA疼痛產(chǎn)生[25-27]。從PPI網(wǎng)絡(luò)及核心蛋白篩選結(jié)果中可以看出，牛膝治療KOA主要作用于與炎癥、細胞周期、細胞增殖和凋亡等相關(guān)的靶點。

GO富集分析結(jié)果表明，在生物過程和分子功能中，細胞外基質(zhì)和細胞因子活性具有顯著意義。人類關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)構(gòu)成，提高軟骨細胞的數(shù)量和促進細胞外基質(zhì)的分泌成為治療骨性關(guān)節(jié)炎的一個重要突破點[28]細胞因子、趨化因子和共刺激分子等均能與成骨細胞和破骨細胞相互作用，共同調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收，進而改變骨重塑的方向[29]。KEGG信號通路富集結(jié)果顯示，牛膝治療KOA主要涉及晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（AGEs-RAGE）、白介素17（IL-17）、腫瘤壞死因子（TNF）等信號通路。AGEs-RAGE信號通路富集最顯著，關(guān)節(jié)軟骨對AGE的積累特別敏感[30-31]，AGE的增加會減少關(guān)節(jié)軟骨細胞中蛋白聚糖和膠原蛋白的合成。AGE的生物學活性被認為是由AGE的特異性受體（RAGE）介導(dǎo)的，RAGE的激活參與了與促炎反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵信號通路，從而激活各種炎癥基因[32]。IL-17可以引起組織損傷和誘發(fā)自身免疫作用[33]。此外，IL-17還可以刺激許多趨化因子，引起滑膜中嗜中性粒細胞，巨噬細胞和淋巴細胞的聚集，從而產(chǎn)生級聯(lián)放大作用，導(dǎo)致更嚴重的關(guān)節(jié)損傷[34]。通過GO和 KEGG 富集分析結(jié)果表明，牛膝治療KOA涉及多方面生物學過程和多條重要信號通路參與，也明確了牛膝治療KOA的作用機制和有效性。

本研究表明，牛膝可以通過多成分、多靶點、多通路機制協(xié)同治療KOA，為中藥牛膝治療KOA提供了重要的分子生物學科學依據(jù)，也為下一步實驗研究奠定基礎(chǔ)和方向。

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（收稿日期：2020-07-20 編輯：程鵬飛）

基金項目：貴州省科技廳合作計劃項目（黔科合LH字[2016]7110號）;貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學技術(shù)研究項目（QZYY2017-015）。

作者簡介：潘莉（1987-），女，漢族，碩士，講師，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail：593509088@qq.com

通信作者：楊孝芳（1975-），女，蒙古族，博士，教授、博士生導(dǎo)師，研究方向為針灸治療心腦血管疾病臨床及機理研究。E-mail：363110152@qq.com