梅毒血清固定患者外周血趨化因子受體、IL-12、IL-10水平變化及意義

駱冬蘭

【摘要】 目的：探究梅毒血清固定患者外周血趨化因子受體、IL-12、IL-10水平變化及意義。方法：選取2016年8月-2019年9月本院收治的梅毒血清固定患者38例為固定組，梅毒治療后非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)轉(zhuǎn)陰患者27例為轉(zhuǎn)陰組，以及進(jìn)行體檢健康者33例為健康對(duì)照組。采用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法檢測(cè)三組外周趨化因子受體CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3水平，采用雙抗體及夾心ELISA法檢測(cè)三組IL-12、IL-10水平，觀察分析三組外周血趨化因子受體、IL-12、IL-10水平的變化及意義。結(jié)果：固定組外周血CCR3表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組（F=255.441，P<0.05），而CCR5、CXCR3表達(dá)均低于轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組（F=70.674、218.128，P<0.05）;轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組外周血細(xì)胞CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;固定組IL-10水平明顯高于轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組（F=48.205，P<0.05），IL-12比轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.173，P>0.05）;ROC曲線顯示，外周血趨化因子受體、IL-12、IL-10水平對(duì)梅毒血清固定的AUC依次為0.838、0.797、0.592、0.908、0.503、0.660。結(jié)論：外周血趨化因子受體、IL-12、IL-10水平對(duì)梅毒血清固定有著一定的診斷價(jià)值，對(duì)梅毒血清固定患者的病情發(fā)展起著很重要的作用。

【關(guān)鍵詞】 梅毒 血清固定 外周血 趨化因子受體 細(xì)胞免疫 細(xì)胞因子

[Abstract] Objective： To investigate the changes and significance of chemokine receptor and IL-12， IL-10 in peripheral blood of patients with syphilis serum fixation. Method： From August 2016 to September 2019， 38 patients with syphilis serum fixation treated in our hospital were selected as the fixed group， after syphilis treatment 27 patients with negative serum test of non-Treponema pallidum antigen were selected as the negative group， and 33 healthy people who underwent physical examination were taken as the healthy control group. The levels of CCR3， CCR5， CXCR4 and CXCR3 of three groups were measured by flow cytometry， and the levels of IL-12， IL-10 of three groups were detected by double antibody and sandwich ELISA. The changes and significance of chemokine receptor and IL-12， IL-10 levels in peripheral blood of three groups were observed and analyzed. Result： The expression of CCR3 in peripheral blood of the fixed group was significantly higher than those of the negative group and the healthy control group （F=255.441， P<0.05）， while the expression of CCR5， CXCR3 were lower than those of the negative group and the healthy control group （F=70.674， 218.128， P<0.05）. The difference of CCR3， CCR5， CXCR4 and CXCR3 in peripheral blood cells between the negative group and the healthy control group were not statistically significant （P>0.05）. The level of serum IL-10 in the fixed group was significantly higher than those in the negative group and the healthy control group （F=48.205， P<0.05）， but the serum IL-12 in the fixed group was lower than those in the negative group and the healthy control group （F=1.173， P>0.05）. The ROC curve showed that the level of the peripheral blood chemokine receptor， IL-12 and IL-10 in the serum of syphilis were 0.838， 0.797， 0.592， 0.908， 0.503， 0.660. Conclusion： The level of chemokine receptor， IL-12 and IL-10 in peripheral blood has a certain diagnostic value for syphilis serum fixation， and plays an important role in the development of syphilis serum fixation patients.

[Key words] Syphilis Serum fixation Peripheral blood Chemokine receptor Cellular immunity Cytokine

First-authors address： Shenzhen Maternity & Child Healthcare Hospital Affiliated to Southern Medical University， Shenzhen 518028， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.24.009

梅毒是由梅毒螺旋體所引起的一種慢性傳播疾病，其主要傳播方式是通過性接觸及血液傳播[1-2]。而梅毒血清固定還可稱為血清抵抗，指的是梅毒患者進(jìn)行規(guī)則治療6～9個(gè)月后滴度無明顯下降或2年后血清反應(yīng)仍然沒有轉(zhuǎn)陰，目前沒有有效的治療方法，這給患者造成巨大的心理壓力。近年來研究發(fā)現(xiàn)，梅毒血清固定與機(jī)體的免疫系統(tǒng)有著較大的關(guān)系[3-4]。本研究通過檢測(cè)健康者、血清試驗(yàn)轉(zhuǎn)陰以及血清固定患者的外周血趨化因子受體和IL-12、IL-10水平，觀察梅毒血清固定患者相對(duì)于健康者與轉(zhuǎn)陰患者各指標(biāo)的變化，分析其對(duì)梅毒血清固定患者的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月-2019年9月本院收治的38例梅毒血清固定患者為固定組，27例梅毒治療后非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)轉(zhuǎn)陰患者為轉(zhuǎn)陰組，以及33例進(jìn)行體檢健康者為健康對(duì)照組，本次研究患者均確診梅毒。梅毒血清固定納入標(biāo)準(zhǔn)：血清固定前已經(jīng)經(jīng)過驅(qū)梅治療未出現(xiàn)癥狀;快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實(shí)驗(yàn)（RPR）持續(xù)陽性，早期持續(xù)時(shí)間≥1年，晚期持續(xù)時(shí)間≥2年。排除標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)梅毒;男性患者（因本院男性患者少，不便收集標(biāo)本）;伴有其他免疫系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病;感染其他性病等。本研究征得院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血趨化因子受體檢測(cè) FITC標(biāo)記的CD4單抗以及相應(yīng)同型對(duì)照抗體、PE標(biāo)記的CCR3單抗、CCR5單抗及相應(yīng)的同型對(duì)照PE-IgG、PE-IgG2A購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司;APC標(biāo)記的CXCR4、CXCR3單抗以及其同型對(duì)照APC-IgG2A購(gòu)于美國(guó)Abcam公司;流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法檢測(cè)外周血CD4+ T細(xì)胞表面CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3水平的表達(dá)。采集三組研究對(duì)象空腹外周血5 mL，并即刻送檢。步驟如下：（1）分別取用5個(gè)離心管標(biāo)記為A、B、C、D、E，其中A管作為陰性對(duì)照;（2）B管加入FITC-CD4單抗（0.5 μg）+PE-CCR3單抗（0.5 μg）;（3）C管加入FITC-CD4單抗（0.5 μg）+PE-CCR5單抗（0.5 μg）;（4）D管加入FITC-CD4單抗（0.5 μg）+APC-CXCR4單抗（0.5 μg）;（5）E管加入FITC-CD4單抗（0.5 μg）+APC-CXCR3單抗（0.5 μg）;（6）各管分別加入100 μL的新鮮抗凝全血，混勻，經(jīng)過避光孵育、裂解、離心、棄上清液后，各管加入1%多聚甲醛溶液150 μL固定后，上機(jī)檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)三組外周血CD4+T細(xì)胞CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3的表達(dá)率。

1.2.2 血清IL-12、IL-10水平檢測(cè) 使用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)三組血清IL-12、IL-10水平。步驟如下：（1）將標(biāo)準(zhǔn)品IL-12稀釋成800、400、200、100、50、25、0 pg/mL（標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1︰1稀釋）;（2）將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)本（50 μL/孔）分別加入抗人IL-12單抗包被的相應(yīng)孔中，封板膠紙封住反應(yīng)孔，放置在微量震蕩器上震蕩、37 ℃ 孵育60 min（洗滌液洗板3次并用吸水紙拍干）;（3）每孔加入80 μL的鏈霉親和素-HRP，膠紙封住反應(yīng)孔，室溫震蕩、37 ℃孵育30 min（洗板3次）;（4）每孔同時(shí)加入底物A、B各50 μL，小心輕振蕩使其混勻，37 ℃溫育10 min（避免光照）;（5）當(dāng)取出酶標(biāo)板后，立即快速加入50 μL的終止液，之后應(yīng)該馬上對(duì)其測(cè)定結(jié)果。在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，對(duì)其繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)標(biāo)本的OD值在曲線上找出其濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，三組比較采用單因素方差分析，多重對(duì)比采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般資料比較 固定組38例，均為女性;年齡20～52歲，平均（31.89±7.12）歲;梅毒程度：Ⅰ期8例，Ⅱ期30例;梅毒血清反應(yīng)素試驗(yàn)滴度1︰1患者8例，1︰2患者13例，1︰4患者16例，1︰8患者1例。轉(zhuǎn)陰組27例，均為女性;年齡21～50歲，平均（32.36±6.47）歲。健康對(duì)照組33例，均為女性;年齡22～55歲，平均（33.12±6.23）歲。三組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 三組外周血趨化因子受體CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3表達(dá)率比較 固定組外周血CCR3表達(dá)比轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組高，而CCR5、CXCR3表達(dá)均低于轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組（P<0.05）;三組外周血CXCR4表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;轉(zhuǎn)陰組與對(duì)照組外周血細(xì)胞CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3 三組IL-12、IL-10水平比較 固定組IL-10水平比轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組高（P<0.05），IL-12比轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.4 外周血趨化因子受體、IL-12、IL-10水平對(duì)梅毒血清固定的診斷價(jià)值 ROC曲線分析顯示，外周血趨化因子受體CCR3、CCR5、CXCR4、CXCR3以及IL-12、IL-10水平對(duì)梅毒血清固定的AUC依次為0.838、0.797、0.592、0.908、0.503、0.660，部分診斷準(zhǔn)確性一定，見圖1、2和表3。

3 討論

梅毒是臨床中常見的一種性傳播疾病，近年來在我國(guó)的發(fā)病率大幅度升高。臨床中，一些梅毒患者在接受規(guī)范的驅(qū)梅治療后，檢驗(yàn)外周血快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實(shí)驗(yàn)（RPR），發(fā)現(xiàn)還是一直呈現(xiàn)出陽性，導(dǎo)致出現(xiàn)血清固定的病癥[5-6]。而今梅毒血清固定的現(xiàn)象已經(jīng)非常普遍，占梅毒患者的較大一部分比例[7-8]。梅毒血清固定對(duì)患者來說危害是非常大的，相關(guān)研究指出，血清固定會(huì)造成患者的內(nèi)臟器官、神經(jīng)系統(tǒng)等受到不同程度的損傷，還會(huì)傳播給下一代，甚至?xí)?dǎo)致胎兒在圍生期死亡等危險(xiǎn)情況出現(xiàn)[9-10]。許多研究已指出，梅毒血清固定與機(jī)體的細(xì)胞免疫功能有著密切的關(guān)系[11-13]。

趨化因子是一類在淋巴細(xì)胞募集中具有非常重要作用的蛋白質(zhì)超家族，趨化因子受體則是一類介導(dǎo)趨化因子與G蛋白相偶聯(lián)的受體[14]，其表達(dá)是趨化因子發(fā)揮作用的一個(gè)比較關(guān)鍵的決定因素。趨化因子及其受體能夠精確的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的各種反應(yīng)，在機(jī)體的生理病理過程中起著很重要的作用[15-16]。此次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固定組與轉(zhuǎn)陰組及健康對(duì)照組比較，外周血趨化因子受體CCR3水平顯著增高（P<0.05），而CCR5、CXCR3水平均顯著降低（P<0.05）;轉(zhuǎn)陰組外周血趨化因子受體與健康對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。表明機(jī)體的正常免疫功能對(duì)于梅毒血清反應(yīng)素試驗(yàn)轉(zhuǎn)陰來說，是一個(gè)比較重要的條件。機(jī)體免疫功能低下，會(huì)造成對(duì)梅毒螺旋體免疫應(yīng)答異常，導(dǎo)致部分梅毒螺旋體避過機(jī)體的細(xì)胞免疫，不能及時(shí)清除所有的梅毒螺旋體，從而感染出現(xiàn)血清固定[17-18]。

正常情況下健康者身體中，血清細(xì)胞因子IL-12、IL-10是處于一個(gè)相對(duì)比較動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，它們能對(duì)人體細(xì)胞免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定進(jìn)行調(diào)節(jié)與維持。但當(dāng)患者出現(xiàn)梅毒血清固定后，使得IL-12、IL-10水平發(fā)生變化，造成免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定性發(fā)生改變[19]。此次研究中，三組IL-10水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且梅毒血清固定組IL-10水平顯著高于轉(zhuǎn)陰組與健康對(duì)照組。此研究結(jié)果與關(guān)楊等[20]研究一致。而三組IL-12水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。由此可見，梅毒血清固定使機(jī)體IL-10水平上升，進(jìn)而抑制T細(xì)胞功能并阻礙Th1介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而使得機(jī)體中的保護(hù)性清除TP的細(xì)胞免疫功能降低，從而導(dǎo)致免疫失去平衡。同時(shí)當(dāng)梅毒患者接受正規(guī)驅(qū)梅治療后，機(jī)體內(nèi)梅毒螺旋體得到清除，細(xì)胞免疫功能就能慢慢地恢復(fù)到正常水平。

本研究通過外周血趨化因子受體、IL-12、IL-10水平的ROC曲線，了解各指標(biāo)對(duì)梅毒血清固定的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示趨化因子受體CCR3、CCR5、CXCR3以及IL-10水平在梅毒患者機(jī)體中起著重要的作用。在臨床中對(duì)梅毒患者的治療，在原有的常規(guī)抗生素驅(qū)梅治療，還需要配合一些免疫調(diào)節(jié)劑來增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，降低梅毒血清固定的發(fā)生率。由于此次研究對(duì)象數(shù)量不多，研究結(jié)果可能會(huì)有一定的不足，故今后還有待進(jìn)一步增加研究對(duì)象深入研究分析。

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（收稿日期：2020-01-08） （本文編輯：程旭然）