列當(dāng)對(duì)腎陽虛模型大鼠血清中內(nèi)分泌激素水平的影響

張 鵬，高珍珍，馬曉彤，馬曉宇，史曉宇，吳靖澤，楊 英

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

腎臟是先天之本，主生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖[1]，腎臟的功能在機(jī)體中具體表現(xiàn)為推動(dòng)臟腑經(jīng)絡(luò)的運(yùn)行,促進(jìn)血液津液的循環(huán)，抵御外邪的侵犯和化生氣血津液等精微物質(zhì)。腎陽虛在動(dòng)物臨床是一種常見的證型也是多種疾病的共同證型[2]。腎陽虛與神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)關(guān)系密切,會(huì)引起下丘腦-腺垂體-靶腺體(腎上腺、甲狀腺、性腺)軸的不同環(huán)節(jié)，不同程度的功能紊亂[3-6]。

宋代《開寶本草》中記載：列當(dāng)性溫味甘，歸肝、腎、大腸經(jīng)，有補(bǔ)腎助陽強(qiáng)筋之功效，補(bǔ)腰腎，令人有子，去風(fēng)血。列當(dāng)屬(Orobanchespp.)有6種藥用植物被我國(guó)少數(shù)民族作為民族藥應(yīng)用[7-8]，常作為肉蓯蓉的代用品[9]。目前多數(shù)研究采用氫化可的松建立腎陽虛大鼠模型[10-14]。本試驗(yàn)以蒙醫(yī)常用的黃花列當(dāng)(Orobanchepycnostachya)為研究對(duì)象，測(cè)定列當(dāng)水煎液對(duì)腎陽虛模型大鼠內(nèi)分泌紊亂的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑黃花列當(dāng)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室提供；氫化可的松購(gòu)自吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)：獸藥字070011270)；肉蓯蓉飲片購(gòu)自安國(guó)市榮華本草中藥材有限公司(中藥飲片符合2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》)；大鼠促性腺激素釋放激素(GnRH)ELISA試劑盒、大鼠促卵泡素(FSH)ELISA試劑盒、大鼠促黃體激素(LH)ELISA試劑盒、大鼠睪酮(T)ELISA試劑盒、大鼠雌二醇(E2)ELISA試劑盒、大鼠促甲狀腺素釋放激素(TRH)ELISA試劑盒、大鼠促甲狀腺素(TSH)ELISA試劑盒、大鼠三碘甲狀腺原氨酸(T3)ELISA試劑盒、大鼠甲狀腺素(T4)ELISA試劑盒、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)ELISA試劑盒、大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)ELISA試劑盒、大鼠皮質(zhì)酮(CORT)ELISA試劑盒均購(gòu)自艾萊薩生物科技(上海)有限公司。

1.2 列當(dāng)與肉蓯蓉水提液的制備稱取黃花列當(dāng)1 000 g，加10倍量的水(即10 L)，浸泡1 h；置于自動(dòng)煎藥機(jī)中水煎1 h，經(jīng)3次水提后，合并3次提取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至4 g/kg。肉蓯蓉水煎液的制備方法同上，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至2 g/kg，兩者均冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動(dòng)物分組健康SD大鼠36只，雌雄各半，雄性體質(zhì)量(250±15) g，雌性體質(zhì)量(200±15) g，購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK蒙2015-0001)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間飼喂全價(jià)飼料，自由飲水進(jìn)食，室溫控制在19～25℃，相對(duì)濕度為30%～70%。將36只SD大鼠隨機(jī)分為6組(n=6)雌雄各半，即空白組、模型組、列當(dāng)?shù)?、中、高劑量組(1.0，2.0，4.0 g/kg)和肉蓯蓉組(2.0 g/kg)。

1.4 腎陽虛模型制備除空白組大鼠外，其他組均后肢肌肉注射氫化可的松25 mg/kg，1次/d，連續(xù)15 d[14]。造模結(jié)束后出現(xiàn)體質(zhì)量下降，飲水量增加，采食量降低,皮毛色澤暗淡無光、雜亂逆立、易脫落、四肢末端及耳尖發(fā)白、精神萎靡、扎堆、拱肩縮背、蜷縮、小便清長(zhǎng)、便溏等現(xiàn)象時(shí)認(rèn)為腎陽虛模型建模成功[15-18]。建模成功后，各給藥組灌服相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組灌服相同劑量蒸餾水，連續(xù)30 d。

1.5 一般情況觀察試驗(yàn)期間每天觀察1次動(dòng)物脫毛、豎毛、蜷縮程度、精神狀態(tài)的變化。每隔7 d測(cè)定并記錄各組大鼠體質(zhì)量的變化。

1.6 血清中激素的檢測(cè)試驗(yàn)31 d大鼠心臟采血，分離血清，-20℃保存。采用ELISA方法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)定各組血清樣品中GnRH、FSH、LH、T、E2、TRH、TSH、T3、T4、CRH、ACTH、CORT的含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0中的One-Way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，Dunkan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，用P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察空白組大鼠在整個(gè)試驗(yàn)過程中均無明顯異常表現(xiàn)；其他各組大鼠腎陽虛癥狀明顯，肌肉注射氫化可的松14 d后出現(xiàn)脫毛、毛發(fā)粗糙、黯淡無光、活動(dòng)減少、體形消瘦、身體蜷縮、四肢末端及耳尖發(fā)白、扎堆、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等肉眼可見的情況。模型組在停止造模之后，隨著時(shí)間的增加腎陽虛癥狀有一定減輕。給藥28 d后，列當(dāng)?shù)汀⒅?、高劑量組和肉蓯蓉組大鼠毛發(fā)較之前順滑濃密，活動(dòng)量增加，蜷縮扎堆的現(xiàn)象減少，四肢末端與耳尖顏色恢復(fù)正常，腎陽虛癥狀較此時(shí)的模型組有較大好轉(zhuǎn)。

2.2 體質(zhì)量分析由表1可見，與空白組比較，給藥前的各組雌性大鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)；給藥7，14，21，28 d后，與模型組比較，各給藥組均無明顯差異(P>0.05)。

表1 對(duì)雌性大鼠體質(zhì)量的影響(x±s,n=3) g

由表2可見，與空白組比較，給藥前的各組雄性大鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)；給藥7 d后與模型組相比，各給藥組均無顯著差異(P>0.05)；給藥14 d 后與模型組相比，肉蓯蓉組體質(zhì)量顯著性增加(P<0.05)，其他給藥組無顯著性差異(P>0.05)；給藥21 d后與模型組相比，肉蓯蓉組體質(zhì)量顯著增加(P<0.05)，其他給藥組無顯著性差異(P>0.05)；給藥28 d后，與模型組比較，各給藥組體質(zhì)量均顯著性增加(P<0.05)。

表2 對(duì)雄性大鼠體質(zhì)量的影響(x±s,n=3) g

2.3 對(duì)大鼠血清GnRH、FSH、LH、T、E2水平的影響由表3可見，與空白組相比，模型組雌鼠血清中的GnRH和E2顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)SH、LH、T顯著上升(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組均能顯著提高腎陽虛雌性大鼠血清中的GnRH和E2(P<0.05)，降低血清中的FSH、LH、T(P<0.05)。中劑量組與肉蓯蓉組之間的各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。隨著列當(dāng)水提液濃度的增加，各給藥組血清中GnRH和E2也隨之增加，F(xiàn)SH、LH、T降低，有明顯的劑量依賴性，高劑量組與空白組各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 雌鼠血清中GnRH、FSH、LH、T、E2含量(x±s,n=3)

由表4可見，與空白組相比，模型組雄鼠血清中GnRH顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)SH、LH和T顯著性升高(P<0.05)。中劑量組與肉蓯蓉之間的各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。隨著列當(dāng)水提液濃度的增加，各給藥組血清中GnRH和T也隨之升高，F(xiàn)SH、LH、E2降低。與模型組相比，高劑量組血清中GnRH和T顯著性上升(P<0.05)，F(xiàn)SH、LH、E2顯著性降低(P<0.05)，與空白相比各項(xiàng)指標(biāo)均差異不顯著(P>0.05)。

表4 雄鼠血清中GnRH、FSH、LH、T、E2含量(x±s,n=3)

2.4 對(duì)大鼠血清TRH、TSH、T3、T4水平的影響由表5,6可見，與空白組相比，模型組血清中TRH、T3、T4顯著性降低(P<0.05)，血清中TSH的含量顯著性上升(P<0.05)。與肉蓯蓉組相比，中劑量組血清中T4的含量顯著性上升(P<0.05)，其他指標(biāo)與肉蓯蓉組無明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，高劑量組血清中TRH、T3、T4顯著上升(P<0.05)，TSH顯著降低(P<0.05)。與空白組相比，高劑量組血清中TRH、TSH、T3、T4均無顯著性差異(P>0.05)。

表5 雌鼠血清中TRH、TSH、T3、T4含量(x±s,n=3)

表6 雄鼠血清中TRH、TSH、T3、T4含量(x±s,n=3)

2.5 對(duì)大鼠血清CRH、ACTH、CORT水平的影響由表7,8可見,與空白組相比，模型組大鼠血清中的CRH、ACTH、CORT顯著降低(P<0.05)。與肉蓯蓉組相比，中劑量組血清中CRH、ACTH、CORT無明顯差異(P>0.05)。與模型組相比，高劑量組CRH、ACTH、CORT顯著上升(P<0.05)。與空白組相比，高劑量組血清中CRH、ACTH、CORT均無顯著性差異(P>0.05)。

表7 雌鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量(x±s,n=3)

表8 雄鼠血清中CRH、ACTH、CORT含量(x±s,n=3)

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為“有諸內(nèi)者，必形諸外”，通過癥狀和體征，可以“司外揣內(nèi)”和“審證求因”，從而對(duì)疾病進(jìn)行辨證論治[13]。腎陽虛證是對(duì)腎陽虛衰、溫煦失職、氣化失權(quán)所產(chǎn)生證候的高度概括。腎為命門之火，是人體陽氣之根本，與生長(zhǎng)發(fā)育和生殖關(guān)系密切。若腎陽虛損，則可導(dǎo)致虛寒衰弱諸證，引發(fā)動(dòng)物代謝器官、免疫器官、生殖器官等出現(xiàn)病理變化，造成功能紊亂[19-21]。

研究表明[6]，腎陽功能與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，而下丘腦-垂體-靶腺軸正常機(jī)能的發(fā)揮是機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)動(dòng)態(tài)穩(wěn)衡的關(guān)鍵。下丘腦分泌GnRH、CRH和TRH調(diào)節(jié)腺垂體FSH、LH、ACT-H、TSH的釋放，其中FSH和LH調(diào)節(jié)T和E2的分泌，ACTH調(diào)節(jié)CORT的分泌，TSH調(diào)節(jié)T3和T4的分泌。T、E2、CORT、T3、T4對(duì)垂體及下丘腦存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。下丘腦、垂體、靶腺在功能上聯(lián)系緊密和互相影響，構(gòu)成了下丘腦-垂體-靶腺軸[22]。腎陽虛通常可引起性腺軸、甲狀腺軸、腎上腺軸激素分泌異常[1]。有研究表明腎陽虛大鼠血清中GnRH水平降低，LH、FSH水平升高，在雄性動(dòng)物中T降低E2升高,雌性反之[22-24]。成雅等[25]和婁勇軍等[26]研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛可使反映下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能的CRH、ACTH、CORT下降。翟旭峰等[27]研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛大鼠血清中TRH、T3、T4下降而TSH上升。血清中各個(gè)激素的含量與機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)功能關(guān)系密切，故本試驗(yàn)檢測(cè)了GnRH、CRH、TRH、FSH、LH、ACTH、TSH、T、E2、CORT共9項(xiàng)指標(biāo)來反映機(jī)體的內(nèi)分泌功能。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組雄鼠體內(nèi)T降低，E2、FSH、LH增高，GnRH分泌降低；模型組雌鼠體內(nèi)T升高，E2降低，結(jié)果與模型組雄鼠相似，F(xiàn)SH、LH增高，GnRH含量降低；模型組雄鼠、雌鼠血液中TRH、T3、T4含量均降低，TSH含量升高；模型組雄鼠、雌鼠血液中CRH、ACTH、CORT含量均降低。提示氫化可的松所致腎陽虛模型大鼠的下丘腦-垂體靶腺軸下丘腦-垂體-性腺軸(HPG)、下丘腦-垂體-甲狀腺軸(HPT)、HPA)均有不同程度的紊亂，表明腎陽虛大鼠模型成功建立。

在灌服列當(dāng)水煎液之后腎陽虛大鼠血清中各項(xiàng)激素水平均有一定程度的恢復(fù)，在一定程度上呈現(xiàn)劑量依賴性，其中高劑量組血清中的GnRH、FSH、LH、T、E2、TRH、TSH、T3、T4、CRH、ACTH、CORT水平與空白組已無明顯差異。從試驗(yàn)結(jié)果來看，列當(dāng)對(duì)腎陽虛模型大鼠的3個(gè)內(nèi)分泌軸(HPG、HPT、HPA)均有調(diào)節(jié)作用，對(duì)其體內(nèi)的內(nèi)分泌紊亂具有很好的治療效果。

列當(dāng)是一種全寄生植物[28]，對(duì)我國(guó)西北地區(qū)農(nóng)作物危害極大，在生產(chǎn)實(shí)踐上通常將其作為雜草處理[29-31]；自古以來民間就有用列當(dāng)代替肉蓯蓉入藥的方法，在一定劑量下與肉蓯蓉的作用效果相似，對(duì)緩解肉蓯蓉資源匱乏，保護(hù)肉蓯蓉野外正常生長(zhǎng)具有積極的意義。但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)并未對(duì)其開展系統(tǒng)深入的研究，列當(dāng)?shù)挠行С煞盅芯恐痪窒抻谏贁?shù)種類，臨床試驗(yàn)研究也極其有限[9]，藥用價(jià)值還未得到很好的開發(fā)。本試驗(yàn)為列當(dāng)“變害為寶”，開發(fā)其經(jīng)濟(jì)價(jià)值提供了數(shù)據(jù)參考，為今后研究其有效成分、作用機(jī)制和獸藥的開發(fā)提供了依據(jù)。