高能低蛋白日糧誘導的脂肪肝出血綜合征(FLHS)蛋雞脂肪組織代謝差異的比較

王玉潔，劉 佳，魏 慶，劉佳婷，茹 盟，彭 剛，曾慶節(jié)，謝賢華，殷 超，黃建珍，梁海平

(江西農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，江西 南昌 330045)

脂肪肝出血綜合征(fatty liver hemorrhagic syndrome,FLHS)是高產(chǎn)蛋雞飼養(yǎng)中常見的一種以大量脂肪異常蓄積且肝臟腫大、出血為主要癥狀的脂肪代謝紊亂疾病。該病主要臨床表現(xiàn)為肥胖和產(chǎn)蛋量下降，剖檢可發(fā)現(xiàn)腹壁、皮下脂肪增多增厚，肝臟甚至心臟有大量脂肪覆蓋，肝臟明顯腫大，體積達正常的2～4倍，顏色呈淡黃色、土黃色；肝臟有一處或多處出血點[1-2]。

FLHS產(chǎn)生的主要原因除遺傳因素外，還與飼養(yǎng)管理不當、環(huán)境等因素有關(guān)。另外，自身雌激素分泌量超過性成熟所需量也容易使雞患FLHS，但主要還是由于營養(yǎng)過剩、能量蛋白比值過大造成的[3]。雞的肝臟是胴體脂肪合成的主要場所，胴體脂肪90%在此合成[4-5]。能量蛋白比值過大會加速乙酰輔酶A向脂肪轉(zhuǎn)化，這使得脂肪在肝臟內(nèi)大量合成；另一方面可能由于日糧中過少的蛋白質(zhì)引起載脂蛋白合成不足，減少了肝臟對脂肪的運出，使其在肝臟異常蓄積，導致肝臟嚴重脂肪變性，最終導致FLHS的發(fā)生[6]。

李秀鈞等[7]研究顯示，脂肪組織通過分泌多種激素信號調(diào)節(jié)分子與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及其他內(nèi)分泌系統(tǒng)器官密切聯(lián)系，與這些系統(tǒng)的器官組織及肝、肌細胞等之間存在細胞對話，因此具有復雜的內(nèi)分泌及代謝功能。例如脂肪組織能夠分泌性激素，特別是雌激素；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、瘦素(leptin，LP)及白細胞介素-8(IL-8)等的信號也是由脂肪組織分泌的，白細胞介素-6(IL-6)約1/3是由脂肪組織合成分泌的[8]。

此外，近年來有研究表明脂肪酸本身也能間接的誘導如IL-6等非特異性免疫相關(guān)的一些細胞因子的表達[9]。這是因為脂肪細胞和炎性細胞中的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)及其他受體的相互作用被其激活，而TLR4與肥胖、慢性炎癥有著一定的聯(lián)系[10]。

IL-6是一種由多種細胞分泌，且作用于多種細胞的細胞因子，其作用包括刺激活化免疫細胞、參與炎癥反應(yīng)、介導應(yīng)激應(yīng)答等。同時作為重要炎性因子的IL-6，其在炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大中有重要意義，其表達水平與炎癥進展在一定程度上呈正相關(guān)[11]。另外，KRALISC等[12]研究顯示IL-6能下調(diào)visfatin mRNA在3T3-L1脂肪細胞中的表達。王淑艷等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血清visfatin水平與IL-6水平呈正相關(guān)。

因此，本試驗以海蘭褐蛋雞為研究對象，采用高能低蛋白日糧飼喂構(gòu)建FLHS疾病模型，比較FLHS蛋雞病理組織形態(tài)差異，進一步比較FLHS蛋雞血清IL-6含量水平及脂肪組織中IL-6 mRNA表達差異變化，從而探討高能低蛋白日糧誘導的FLHS蛋雞脂肪組織的代謝差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型及分組80只(其中80%處于產(chǎn)蛋高峰期)海蘭褐蛋雞以籠養(yǎng)的方式預(yù)飼養(yǎng)1周，無應(yīng)激等異常狀態(tài)，將其隨機分為病理組與對照組。對照組給予基礎(chǔ)日糧，病理組給予高能量低蛋白日糧。自由采食與飲水，每日早、晚各飼喂1次，并進行免疫接種和常規(guī)驅(qū)蟲。給予16 h光照，并保持舍內(nèi)溫度在28～32℃。不同日糧飼喂40 d后采集組織樣品，若通過高能低蛋白日糧飼養(yǎng)的蛋雞中超過70%發(fā)生FLHS，則表明FLHS模型建立成功[16]。飼喂80 d后采集相關(guān)組織樣品進行試驗。

1.2 試驗日糧實驗蛋雞所用基礎(chǔ)日糧依據(jù)NRC(1994)飼養(yǎng)標準蛋雞營養(yǎng)需要量配置而成，其配方組成及營養(yǎng)水平見表1。日糧配方參照文獻[14]配方，對照組使用的基礎(chǔ)日糧蛋能比為1.41 MJ/kg，病理組使用的高能低蛋白日糧蛋能比為0.93 MJ/kg。

表1 試驗日糧組成配方及營養(yǎng)水平 %

1.3 樣品的采集翅下靜脈采血后迅速處死蛋雞，打開腹腔后采集其肝臟、脂肪組織。所采集血液置于EP管中37℃靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，取上清液于-20℃保存，用于血清含量測定。部分脂肪組織與肝臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蠟切片的制作與HE染色。另取脂肪組織置于EP管中并迅速浸入液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 肝臟樣品石蠟切片將采集的部分脂肪組織與肝臟組織經(jīng)過4%多聚甲醛溶液固定后，制作石蠟切片與HE染色，在光學顯微鏡下進行組織形態(tài)觀察。

1.5 熒光定量PCR法測定

1.5.1RNA的提取和cDNA的合成 取適量于-80℃ 保存的新鮮脂肪組織，置于預(yù)先裝有1 mL RNAiso Plus的EP管中，用研磨棒在保持低溫的條件下研磨成勻漿，采用Trizol法提取總DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性與濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，分為2個步驟進行。采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系1(10 μL)：gDNA Eraser 1 μL，RNase Free dH2O 6 μL， 5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，模板 1 μL，42℃ 2 min，去除gDNA；采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系2(10 μL)，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ 1 μL，5×PrimeScript Buffer2 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL，RT primer Mix 1 μL，37℃ 15 min，獲得cDNA。

1.5.2目的基因PCR擴增、引物設(shè)計及檢驗 本試驗所用IL-6的基因序列來源于GenBank發(fā)表在NCBI中的基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表2)。以β-actin為內(nèi)參基因，目的基因擴增片段需通過測序檢驗無誤后確定。

表2 目的基因和內(nèi)參基因擴增引物信息

1.5.3實時熒光定量PCR反應(yīng) 通過ABI 7500熒光定量PCR儀進行real-time Q-PCR分析(模板：反轉(zhuǎn)錄所得cDNA；內(nèi)參基因：β-actin)，所得數(shù)據(jù)在內(nèi)參基因與目的基因擴增效率相近的前提下，樣品每個重復3次。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0進行單因素ANOVA分析。試驗結(jié)果以x±s表示：P<0.05表示差異顯著；P>0.05表示差異不顯著；P<0.01表示差異極顯著。利用2-△△Ct公式進行計算，獲得目的基因相對于內(nèi)參基因的表達豐度。試驗結(jié)果用Graphpad prism 8.0軟件作圖，脂滴(LDs)大小通過Image-J軟件獲取。

2 結(jié)果

2.1 剖檢剖解后可見FLHS組的腹腔內(nèi)有明顯的脂肪沉積，肝臟體積變大，組織松脆，表面黃染，油膩(圖1A)。對照組肝臟體積正常，觸感柔軟，顏色光澤、鮮艷正常(圖1B)。

圖1 肝臟解剖圖(n>10) A.FLHS組；B.對照組

2.2 HE染色

2.2.1肝臟組織HE染色 結(jié)果顯示，F(xiàn)LHS組中，肝臟細胞相對松散，發(fā)生脂肪變性，細胞間質(zhì)與胞漿內(nèi)出現(xiàn)許多脂肪空泡，細胞核向細胞邊緣移動(圖2A)。對照組肝臟細胞邊界清晰，排列整齊，未出現(xiàn)脂肪空泡(圖2B)。

圖2 肝臟組織HE染色圖(n>10) A.FLHS組；B.對照組

2.2.2脂肪組織HE染色 FLHS組脂肪組織HE染色如圖3A所示，對照組脂肪組織HE染色如圖3B所示，對照組及試驗組LDs直徑大小比較如圖4所示。結(jié)果表明，對照組的脂肪空泡更加密集且更小，而FLHS組LDs直徑顯著大于對照組LDs(P<0.05)。

圖3 脂肪組織HE染色圖(n>10) A.FLHS組；B.對照組

圖4 LDs大小比較(n=17) 注：*示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。下同

2.3 血清IL-6水平由表3可見，F(xiàn)LHS組血清IL-6水平顯著高于對照組(P<0.01)。

表3 血清IL-6水平檢測結(jié)果(n>10)

2.4 IL-6在FLHS脂肪組織中的表達圖5結(jié)果顯示，脂肪組織的IL-6表達在對照組與FLHS組中差異顯著(P<0.05)。

圖5 IL-6在脂肪組織中的表達差異(n=6)

3 討論

3.1 FLHS病理模型的建立蛋雞FLHS在集約化蛋雞養(yǎng)殖場疾病中較為常見。其以脂肪在肝臟中過度沉積，表面呈土黃色且油膩，并伴有出血等為典型癥狀。FLHS產(chǎn)生的原因主要為遺傳、飼養(yǎng)管理不當、環(huán)境以及激素等，而營養(yǎng)不均衡是目前在集約化蛋雞養(yǎng)殖中發(fā)生FLHS的主要誘因。目前蛋雞FLHS模型的建立方法有很多種：董曉芳等[18]通過外源注射雌二醇成功建立蛋雞FLHS模型；姜錦鵬

等[19]通過飼喂復合高脂日糧與雌激素肌肉注射也成功建立蛋雞FLHS模型。同時有研究表明飼喂高能低蛋白日糧可誘導FLHS的發(fā)生。左文君[20]通過飼喂含牛磺酸的高能低蛋白飼糧成功建立蛋雞FLHS模型；黃恩福[14]和郭小權(quán)等[21]通過飼喂高能量低蛋白日糧成功建立蛋雞FLHS模型；邢玉娟等[22]通過飼喂不同配比的高脂飼料成功建立蛋雞FLHS模型等。本試驗飼喂海蘭褐蛋雞高能低蛋白日糧80 d后，病理組的剖檢結(jié)果以及肝臟組織的HE染色與對照組結(jié)果對比：病理組蛋雞肝臟表面呈現(xiàn)黃褐色且油膩，HE染色結(jié)果呈現(xiàn)許多脂肪空泡等，以上結(jié)果表明肝臟中脂肪過度沉積，進而表明FLHS模型成功建立。

3.2 高能低蛋白日糧對肝臟組織的影響脂肪組織是重要的能量代謝器官，機體多余的能量主要儲存于脂肪組織中。動物脂肪細胞LDs是中性脂肪的儲存庫，因此LDs的主要作用是儲存能量。本試驗脂肪組織HE染色結(jié)果顯示：FLHS組中的脂肪細胞LDs的直徑顯著大于對照組。這一結(jié)果表明本試驗中過多的能量攝入導致蛋雞能量過剩，從而儲存在脂肪組織中，進而導致脂肪細胞的LDs直徑增大。

3.3 高能低蛋白日糧對IL-6含量的影響脂肪組織不僅是能量代謝器官，同時也是重要的內(nèi)分泌器官。研究表明，脂肪組織是IL-6的主要生成場所，同時IL-6作為抗炎癥細胞因子之一，在正常水平對機體起到保護作用。WANG等[10]研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸可通過Toll樣受體4及其他受體相互作用，啟動以信號通路為代表的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導IL-6等細胞因子的表達。本試驗血清生化指標結(jié)果表明：FLHS組蛋雞血清IL-6含量極顯著的高于對照組(P<0.01)，與賴敏等[23]對非酒精性脂肪肝患者血清IL-6含量檢測結(jié)果十分相似，提示高能量低蛋白日糧誘導的FLHS，可引起脂肪組織炎性反應(yīng)，進而推測可能是FLHS發(fā)展過程中引發(fā)胰島素抵抗等的并發(fā)癥原因之一。

王楠楠等[24]研究表明，通過給予大鼠飼喂一段時間的植物油可導致大鼠脂肪增多、蓄積，且脂肪細胞IL-6的表達水平顯著提升(P<0.05)；BUETTNER[25]通過飼喂基于豬油、魚油、橄欖油等高脂肪飼料導致大鼠出現(xiàn)明顯的肥胖、血脂升高及脂肪組織IL生成增多，進而引發(fā)胰島素抵抗等。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。這些結(jié)果提示了脂肪細胞出現(xiàn)代謝異常，甘油三酯大量蓄積促進了脂肪組織IL-6 mRNA的表達水平。同時表明IL-6的水平對于FLHS的發(fā)生、發(fā)展有重要的意義，但IL-6的水平升高對FLHS的發(fā)生、發(fā)展所產(chǎn)生的影響有待進一步研究。

綜上所述，高能低蛋白日糧的飼喂可成功誘導FLHS的發(fā)生；FLHS組中的脂肪細胞LDs的直徑顯著增大；FLHS的蛋雞血清IL-6含量極顯著性升高(P<0.01)，同時FLHS蛋雞脂肪組織IL-6的mRNA表達水平也顯著性升高(P<0.05)，表明高能低蛋白日糧誘導的FLHS蛋雞脂肪組織出現(xiàn)代謝異常。