高通量測序DNA文庫定量質(zhì)控技術(shù)研究

王 霞， 歐陽艷艷， 王 晶， 王尚君， 董蓮華

(1.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029；2.南京市計量監(jiān)督檢測院，江蘇 南京 210049)

1 引 言

基因測序技術(shù)和產(chǎn)業(yè)始于1990年啟動的人類基因組計劃[1]，是被全球生物科技界公認的對人類健康事業(yè)影響深遠的基礎(chǔ)性技術(shù)和效益外溢性極強的產(chǎn)業(yè)?；蛐蛄袦y量的準確性直接關(guān)系到人們對于生命活動的判斷，例如癌癥診斷[2～4]、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷[5]等。高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing)又稱下一代測序技術(shù)(next generation sequencing technology, NGS technology)，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志[6]，使得對一個物種的基因組深度測序變得方便易行。

目前市場主流NGS測序儀包括Illumina和Life Technologies公司的測序平臺[7,8]，這2大測序平臺文庫的定量分析和質(zhì)量評價對于獲得高質(zhì)量的核酸測序數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵。如果過高的估計測序文庫拷貝數(shù)，將不能獲得足夠的測序數(shù)據(jù)，導(dǎo)致降低數(shù)據(jù)產(chǎn)出；如果過低的估計測序文庫拷貝數(shù)，將產(chǎn)生低質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，甚至?xí)?dǎo)致測序失敗。因此，要控制NGS測序文庫的載入量，保證測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，就需要在測序前對DNA測序文庫進行定量質(zhì)量控制。此外，為減少NGS運行成本，往往需要將不同測序文庫等摩爾量合并為一份測序樣品同時測序，這也以測序文庫的準確定量分析為前提，這樣才能保證不同文庫的測序數(shù)據(jù)的可靠性。

因此本研究以主流的Illumina高通量平臺為對象，開展DNA文庫定量質(zhì)量控制技術(shù)研究，建立了DNA文庫絕對定量數(shù)字PCR方法，可用于DNA文庫定量標(biāo)準物質(zhì)的定值。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5為中國計量科學(xué)研究院保存；5個水平的文庫定量標(biāo)準物質(zhì)由中國計量科學(xué)研究院研制；SYBR熒光染料試劑盒購置于江蘇康為世紀生物科技有限公司；數(shù)字PCR芯片和GE loading試劑購自美國Fluidigm公司；EvaGreen mastermix購自美國伯樂公司。

2.2 方法

2.2.1 熒光定量PCR

采用Roche480熒光定量PCR儀，分別測定KAPA公司和Qiagen公司的定量標(biāo)準品。PCR擴增體系20 μL：2×SYBR PCR mastermix 10 μL，雙向引物(濃度為10 μmol/L)0.4 μL，DNA模板4 μL，ddH2O 5.6 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s， 60 ℃ 40 s，45 cycles。熔解曲線：95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min， 95 ℃連續(xù)采集信號。

2.2.2 數(shù)字PCR方法

采用數(shù)字PCR方法測定文庫定量標(biāo)準物質(zhì)的拷貝數(shù)濃度，再通過式(1)換算成摩爾濃度。按照下述步驟進行芯片數(shù)字PCR反應(yīng)液的配制。

(1)

式中：cmol為摩爾濃度，pmol/L；ccopy為拷貝數(shù)濃度，copy/L；NA為阿伏加德羅常數(shù)。

芯片數(shù)字PCR(cdPCR)方法的實驗操作步驟[9]：首先對12×765芯片標(biāo)記A1的一端孔內(nèi)加入1 mL的礦物油，然后將芯片放入加樣器(IFC controller)，點擊“prime”對芯片進行prime。待prime完成后，首先在12×765芯片樣品孔的兩端孔內(nèi)加入10 μL的無DNA水；然后將配制好的含有DNA模板的PCR反應(yīng)液10 μL(包括5 μL的SYBR master mix，0.2 μL的引物，0.5 μL的GE loading，0.1 μL的ROX，2 μL的DNA，2.2 μL的TE)加入到標(biāo)記1～12的樣品孔內(nèi)，其中孔1～11加入DNA樣本，第12個孔加入NTC(無DNA對照)。再將芯片轉(zhuǎn)移至加樣器，點擊“l(fā)oad”進行樣品的加入。待樣品加樣完成后將芯片轉(zhuǎn)入BioMark數(shù)字PCR儀進行PCR擴增。擴增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，45 cycles，PCR擴增結(jié)束后采用Fluidigm的Digital PCR analysis軟件進行分析處理。

微滴數(shù)字PCR(ddPCR)實驗操作步驟見之前的文獻報道[10～12]，微滴生成在微滴發(fā)生卡上進行：將配制好的含有DNA模板的PCR反應(yīng)液20 μL(包括10 μL的EvaGreen master mix、0.4 μL的引物、4 μL的DNA、5.6 μL的TE)加入到標(biāo)記有“Sample”的樣品孔內(nèi)，加入60 μL的微滴生成油至標(biāo)記有“Oil”孔內(nèi)。然后將微滴發(fā)生卡轉(zhuǎn)移至微滴生成儀。待生成微滴后，轉(zhuǎn)移微滴至96孔板，然后進行PCR擴增。擴增好的96孔板在在微滴閱讀器上閱讀微滴。數(shù)據(jù)采用軟件QuantaSoft 1.7.4版本進行分析。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 熒光定量PCR方法

以大腸桿菌DNA文庫為模板使用上述PCR引物和擴增條件擴增后的得到的熔解曲線為一單峰，如圖1(a)所示，tm(DNA熔解溫度)為80 ℃左右；而以其它非特異性DNA作為模板，使用同一PCR引物和擴增條件進行擴增后得到的熔解曲線不是單一峰，如圖1(b)所示。

圖1 DNA文庫定量PCR擴增熔解曲線Fig.1 Melting curves of DNA library quantitative PCR amplification

因此，可以很清楚地根據(jù)熔解曲線來判斷該PCR方法具有良好的擴增特異性。

3.2 芯片式數(shù)字PCR

將優(yōu)化好的PCR方法及體系平行轉(zhuǎn)移至cdPCR平臺上進行絕對定量準確性及一致性研究。一張芯片12個孔，其中孔1～11加入DNA樣本，第12個孔加入NTC(無DNA對照)。擴增結(jié)果見圖2，首先從圖2中的陰性對照(NTC，Panel12)看，沒有熱點(深色點)出現(xiàn)，表明擴增體系中沒有DNA污染；其次看標(biāo)準物質(zhì)的擴增結(jié)果(Panel 9～11)，每個Panel中擴增得到的熱點(深色點)數(shù)目介于400～700之間(見表1)，λ即每個反應(yīng)室內(nèi)的平均分子數(shù)為1.22～1.28，且分布隨機。表明加入的起始DNA分子濃度適中，且得到了較好的擴增。

圖2 芯片數(shù)字PCR(cdPCR)擴增結(jié)果圖Fig.2 Amplification results of chip digital PCR (cdPCR)

3.3 微滴數(shù)字PCR

ddPCR擴增結(jié)果見圖3。擴增生成的總微滴數(shù)和陽性微滴數(shù)見表2。樣本擴增結(jié)果(F02)(通道1)得到了兩簇(陽性微滴和陰性微滴)微滴，表明建立的ddPCR方法得到了較好的擴增；而陰性對照(E05)擴增結(jié)果僅為一簇微滴，從熒光值判斷為陰性微滴，陽性微滴個數(shù)為0，表明擴增體系干凈無污染。

表1 每個Panel的陽性反應(yīng)室數(shù)目和每個反應(yīng)室內(nèi)的平均DNA分子數(shù)Tab.1 Number of positive reaction chambers per Panel and average number of DNA molecules per reaction chamber

圖3 微滴數(shù)字PCR(ddPCR)擴增結(jié)果圖Fig.3 Amplification results of droplet digital PCR (ddPCR)

3.4 不同數(shù)字PCR平臺可比性

采用cdPCR和ddPCR對所研制的Level 2水平的文庫定量標(biāo)準物質(zhì)定值，考察不同平臺的一致性。對芯片每個單反應(yīng)小室和每個微滴的體積進行修正后[13]，驗證結(jié)果表明對同一標(biāo)準物質(zhì)測定時兩種平臺測量結(jié)果一致(見表3和圖4)。

由于ddPCR方法中微滴數(shù)顯著多于cdPCR中的反應(yīng)小室個數(shù)，所以ddPCR方法的精密度好于cdPCR方法的精密度，這與測量不確定度的評定結(jié)果一致。從表4可以看出ddPCR由測量方法精密度引入的不確定度ua顯著優(yōu)于cdPCR。綜合考慮所有不確定度來源，分別將其合成得到ddPCR和cdPCR的擴展不確定度，ddPCR優(yōu)于cdPCR。2個數(shù)字PCR平臺測量結(jié)果的不確定度分量見表4。

圖4 不同數(shù)字PCR平臺對同一標(biāo)準物質(zhì)量值的驗證結(jié)果Fig.4 Verification results of different digital PCR platforms on the same standard substance value

表2 微滴數(shù)字PCR陽性微滴數(shù)和總微滴數(shù)Tab.2 number of positive dorplets and total accepted droplets in droplet digital PCR

3.5 標(biāo)準物質(zhì)適用性驗證

制備了5個水平的文庫定量標(biāo)準物質(zhì)，其目的是用于制作熒光定量PCR的標(biāo)準曲線來定量測定測序DNA文庫濃度，所以5個水平的標(biāo)準物質(zhì)經(jīng)過熒光定量PCR擴增后的線性需要進行檢驗。將制備好的5個不同水平的DNA文庫標(biāo)準物質(zhì)作為模板，采用建立的PCR擴增體系和擴增程序進行擴增，檢測結(jié)果如圖5(a)。以拷貝數(shù)對數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)得到的標(biāo)準曲線為：y=-3.74x+38.87，R2=0.995，標(biāo)準曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，如圖5(b)，斜率對應(yīng)的擴增效率為85%?？梢?個水平的標(biāo)準物質(zhì)經(jīng)過熒光定量PCR擴增后線性關(guān)系良好，可以作為DNA文庫定量的標(biāo)準曲線。

表3 cdPCR和ddPCR對Level 2標(biāo)準物質(zhì)測定結(jié)果比較Tab.3 Comparison in measurement result of reference material of Level 2 determined by cdPCR and ddPCR

表4 cdPCR和ddPCR方法的測量結(jié)果不確定度評定Tab.4 Uncertainty evaluation of measurement result determined by ddPCR and cdPCR

圖5 5個水平文庫定量標(biāo)準物質(zhì)熒光定量PCR擴增曲線和標(biāo)準曲線Fig.5 Fluorescence quantitative PCR amplification curves and standard curves of 5 level libraries

4 結(jié) 語

本文以主流的Illumina高通量測序平臺為對象，開展DNA文庫定量質(zhì)量控制技術(shù)研究，建立了基于SYBR Green熒光染料嵌合的高特異性數(shù)字PCR絕對定量方法，用于DNA文庫定量標(biāo)準物質(zhì)的定值，并對制備的文庫定量標(biāo)準物質(zhì)的適用性進行了驗證。結(jié)果表明制備的5個水平的文庫定量標(biāo)準物質(zhì)線性良好，可以作為Illumina平臺DNA文庫定量的標(biāo)準曲線。