解毒祛瘀方通過抑制巨噬細胞凋亡和增加脂代謝改善動脈粥樣硬化斑塊進展

姚 璠，孫三苗，冷向陽，任吉祥，王澤玉，趙為民

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種由動脈壁脂質(zhì)沉積所引發(fā)的一種病理生理過程，高血脂是主要危險因素之一。Zhang 等[1]統(tǒng)計163 641 位成年人的血脂水平，發(fā)現(xiàn)全國TC、HDL-C、LDL-C 的人口加權(quán)平均值和TG 中位數(shù)分別為4.70、1.35、2.88和1.49 mmol/L；高TC、高LDL-C、低HDL-C、高TG 患病率分別為6.9%、8.1%、20.4%、13.8%；ASCVD 高危人群中，74.5% 的人LDL-C 水平失控（＜2.6 mmol/L），5.5%的人接受了治療；對于非常高危的個體，93.2%沒有達到降低LDL 的目標（＜1.8 mmol/L），其中14.5%接受了治療。王耀等[2]通過對臨床病人進行觀察，發(fā)現(xiàn)血脂水平高的患者動脈粥樣硬化發(fā)生率也高。陳孔等[3]研究發(fā)現(xiàn)在早期動脈粥樣硬化中，巨噬細胞吞噬斑塊中沉積的脂質(zhì)、凋亡或壞死的細胞及細胞碎片，并將其清除，隨著病程繼續(xù)進展，越來越多的脂質(zhì)沉積，同時巨噬細胞的吞噬及清除能力下降，形成了富含脂質(zhì)的泡沫細胞，導致細胞凋亡和炎性反應。

國醫(yī)大師任繼學原創(chuàng)性提出了中醫(yī)伏邪理論，在古方《驗方新編》四妙勇安湯的基礎上形成了解毒祛瘀方（金銀花、三七粉、地龍、玄參、當歸、川芎、生山楂、甘草），提出了“以解毒祛瘀方干預動脈粥樣斑塊形成”的治療策略，臨床效果顯著。漆仲文等[4]研究證明四妙勇安湯可以減輕動脈斑塊的病變程度。解毒祛瘀方在四妙勇安湯原方基礎上增加了三七、地龍、川芎和生山楂，增強了其活血、化瘀、通絡的功效。李晶潔等[5]臨床觀察表明三七粉聯(lián)合他汀類藥物治療頸動脈斑塊臨床療效顯著，明顯優(yōu)于單純使用他汀類藥物，可有效減少頸部斑塊，預防斑塊的生成。周建國等[6]通過觀察發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以抑制動脈組織脂質(zhì)沉積,調(diào)節(jié)MMP-9 和TIMP-1 的表達，進而起到穩(wěn)定斑塊的作用。鐘麗霞等[7]研究結(jié)果表明山楂粗多糖具有一定的降血糖、降血脂作用。陳萍[8]通過觀察地龍多肽對高血脂大鼠的血脂變化，發(fā)現(xiàn)地龍多肽有較顯著的降脂效果。可以發(fā)現(xiàn)解毒祛瘀方中的藥物對于血脂及動脈粥樣硬化大多都是有益的。本文旨在研究解毒祛瘀方治療動脈粥樣硬化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞獲取和培養(yǎng) 取6 周左右的小鼠，斷頸處死，剃掉腹部的毛，在75%酒精中浸泡5 s，將小鼠四肢固定，75%酒精消毒腹壁，用9 號針頭5 mL 注射器沿腹中線將預冷的PBS 5 mL 注入腹腔中，可用手指輕揉腹壁，2～3 min，靜置7 min。無菌條件下剪開腹壁，暴露腹膜，再次消毒后將小鼠傾向一側(cè)，注射器吸出液體，注入50 mL 離心管內(nèi)。同樣做法重復2～4 次，沖洗液變澄清為止。4 ℃、400×g 離心6 min，去上清，再用PBS 同樣條件下洗滌細胞3 次，去上清，加入含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素10 μg/mL），用槍頭吹打，使細胞懸浮。計算細胞濃度，以5×106個/mL 鋪到培養(yǎng)皿中，放入5%CO2、37 ℃恒溫、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h 后洗去未貼壁的細胞，得到純化的貼壁巨噬細胞。細胞生長面積達到70%～80%時進行傳代，即用胰酶將細胞消化后重懸，加入培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實驗動物 雄性ApoE 基因敲除小鼠8 周齡，體質(zhì)量19～21 g，清潔級為SPF 級，由長春中醫(yī)藥大學動物中心提供，動物合格證號：SCXK（吉） 2010-0008。飼以含脂肪21%（wt/wt），膽固醇1.25%（wt/wt）的高脂飼料。

1.3 實驗儀器 超凈臺（蘇州凈化設備有限公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司），低溫冰箱（青島海爾股份有限公司），倒置顯微鏡 （日本奧林巴斯公司），制冰機 （河南華豫兄弟公司），電子天平（北京賽多利斯公司），純水系統(tǒng)（四川沃特爾科技有限公司），恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司），離心機（北京吳諾思科技有限公司），流式細胞儀[貝克曼庫爾特生物科技（蘇州）有限公司]，凍干機（上海拓紛機械設備有限公司），離心機（側(cè)維光電TG16A-WS，上海）。

1.4 實驗藥品與試劑 解毒祛瘀方中藥制劑 （本院中藥飲片），胎牛血清（四季青公司），高脂飼料（華雅再生醫(yī)學工程技術有限公司），辛伐他汀（國藥集團容生制藥有限公司），RPMI-1640 培養(yǎng)液（賽默飛世爾儀器有限公司），胰酶（Gibco 公司美國），DMSO（Sigma 公司，美國），青霉素/鏈霉素（160 萬 u/100mL，Sigma 公司，美國），PBS（賽默飛世爾儀器有限公司），12 孔培養(yǎng)板（NEST 公司，中國），一次性針頭過濾器 0.22 um （美國 Coring Costar 公司），無菌注射器 （山東威高集團公司），TG、TC 檢測試劑盒（北京雷根生物科技有限公司），人氧化低密度脂（廣州奕元生物科技有限公司）。

1.5 分組及給藥 細胞實驗分為5 組，1）正常組（對照組）：加入RPMI-1640 培養(yǎng)液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素10 μg/mL）；2）Ox-LDL 對照組（模型組）：加入含80 μg/mL Ox-LDL 的RPMI-1640 培養(yǎng)液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素10 μg/mL）；3）低劑量治療組：加入含80 μg/mL Ox-LDL 和50 μg/mL JDQY 的RPMI-1640 培養(yǎng)液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素10 μg/mL）；4）中劑量治療組：加入含80 μg/mL Ox-LDL 和100 μg/mL JDQY 的RPMI-1640 培養(yǎng)液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素10 μg/mL）；5）高劑量治療組：加入含80 μg/mL Ox-LDL 和200 μg/mL JDQY 的RPMI-1640 培養(yǎng)液（10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素10 μg/mL）。5% CO2、37 ℃恒溫、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取出，用胰酶消化后進行檢測。

動物實驗將60 只ApoE-/-小鼠分為6 組，分別為對照組、模型組、低濃度治療組、中濃度治療組、高濃度治療組和辛伐他汀組，每組10 只。對照組給予普通飼料，其余組給予高脂飼料喂養(yǎng)。8 周后，低、中、高濃度治療組分別按解毒祛瘀方5、10、20 g/kg 體質(zhì)量給藥，辛伐他汀組按2.6 mg/kg 體質(zhì)量給藥，對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，均按照每日1次灌胃，連續(xù)給藥8 周。采集血液前，禁食12 h。解毒祛瘀方制備：原方熬制三遍后，將藥液混在一起濃縮、過濾、凍干，再加蒸餾水（細胞用PBS）溶解至50 mg/mL 濃度冷凍儲存

1.6 觀察指標 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)為1.5×105個/mL，接種于24 孔板，待細胞貼壁后，分組方法同前，含藥培養(yǎng)基加入24 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化細胞，PBS洗2次，按試劑盒說明書要求染色后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

采用割(剪)尾采血法，固定動物并露出鼠尾，將尾部毛剪去后消毒，然后浸在 45℃左右的溫水中數(shù)分鐘，使尾部血管充盈。再將尾擦干，割破尾動脈收集血液。小鼠每次可取血 0.1 mL。按照試劑盒說明書檢測小鼠血清TG 和TC 水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件，采用方差分析（ANOVA）模塊，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 解毒祛瘀方對ox-LDL 誘導的RAW 264.7 巨噬細胞凋亡的影響 RAW 264.7 細胞在分組培養(yǎng)24 h 后，進行檢測。空白對照組與模型組相比凋亡細胞較少，治療組凋亡細胞數(shù)較模型組減少（如圖1）。

圖1 解毒祛瘀方對ox-LDL 誘導的RAW 264.7 巨噬細胞凋亡的影響

2.2 解毒祛瘀方對高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠血液中TC和TG 的影響 小鼠喂養(yǎng)8 周后，檢測血中TG、TC水平，模型組TG、TC 較對照組均明顯升高，低、中、高劑量解毒祛瘀方組可以有效降低TG、TC 水平，且有一定劑量依賴性（如圖2）。

圖2 解毒祛瘀方對高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠血液中TC 和TG的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，細胞實驗中解毒祛瘀方可以減少動脈粥樣硬化過程中由于高脂引發(fā)的巨噬細胞凋亡。巨噬細胞在加入Ox-LDL 后凋亡率與對照組相比明顯增加，加入解毒祛瘀方后凋亡率有所下降，其中中劑量治療組與模型組相比減少巨噬細胞凋亡的作用最強。在動物實驗中，可以觀察到模型組與對照組相比，TC、TG 水平均明顯升高（P＜0.05），而各治療組與模型組相比TC 水平均顯著下降，TG 水平中高劑量治療組下降水平最明顯，辛伐他汀組TG 水平下降程度不如解毒祛瘀方各組下降明顯。

Xiao Qingqing 等[9]發(fā)現(xiàn)7-酮基膽固醇（7-KC,ox-LDL 中主要的氧甾醇之一）引起巨噬細胞凋亡與伴隨的線粒體的損傷，表現(xiàn)為線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷，細胞色素C 的釋放，線粒體潛在的耗散,線粒體分裂，過量的活性氧生成和Caspase-9 和Caspase-3 激活；許金鵬等[10]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞凋亡造成的動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)學改變，會影響斑塊易損性，從而造成斑塊不穩(wěn)定。而不穩(wěn)定斑塊是各種急性心腦血管疾病發(fā)生的重要條件。本研究發(fā)現(xiàn)解毒祛瘀方可以減少由高脂誘導的巨噬細胞凋亡，我們猜測，解毒祛瘀方可能是通過抑制動脈粥樣硬化過程中巨噬細胞的凋亡來改善動脈粥樣硬化斑塊的進展的。

脂質(zhì)浸潤是動脈粥樣硬化斑塊形成的重要病理基礎。血管內(nèi)皮受到修飾低密度脂蛋白持續(xù)的慢性影響，產(chǎn)生損傷，內(nèi)皮細胞釋放趨化因子，導致單核細胞、淋巴細胞等炎性細胞在內(nèi)皮損傷處黏附、聚集，由于內(nèi)皮損傷通透性改變，單核細胞浸潤到內(nèi)膜下，分化成巨噬細胞，從而由清道夫受體（Scavenger receptors,SR）攝入氧化型低密度脂蛋白膽固醇，形成泡沫細胞，使斑塊形成。2018 歐洲心臟病協(xié)會發(fā)表的共識文件[11]中明確指出血脂異常對動脈粥樣硬化的影響有著密切的關系。各大指南也都把調(diào)脂藥物作為臨床主要推薦用藥之一。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，解毒祛瘀方對與AS 密切相關的高脂環(huán)境有明顯的改善作用。

修飾氧化低密度脂蛋白膽固醇在引起內(nèi)皮損傷，炎性細胞聚集后，釋放大量炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor α，TNF-α）、干擾素γ（Interferon γ,INF-γ）、白細胞介素6（Interleukin 6,IL-6）等，促進炎癥反應，加速細胞凋亡。從實驗中發(fā)現(xiàn)高脂環(huán)境可以對巨噬細胞凋亡起到積極作用。因此，解毒祛瘀方改善動脈粥樣硬化斑塊機制可能是通過降低血脂—減少巨噬細胞凋亡實現(xiàn)的。