大曲液化酶活力測(cè)定方法比較分析

劉璐(長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 長春 130031)

0 引言

在大曲諸多理化指標(biāo)檢測(cè)過程當(dāng)中，液化力充分反映了大曲微生物以及酶對(duì)淀粉的降解能力，有著非常突出的以應(yīng)用價(jià)值。液化淀粉酶能將淀粉分子鏈中的α-1,4 葡萄糖苷鍵隨機(jī)切斷成長短不一的短鏈糊精、少量的麥芽糖和葡萄糖，其顏色消失的速度與酶活性有關(guān)，據(jù)此可以測(cè)定液化酶活力。本文嘗試對(duì)比傳統(tǒng)比色法與分光光度法在大曲液化酶活力測(cè)定中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所需儀器包括滴定管、恒溫水浴鍋、自動(dòng)移液器、試管、燒杯、容量瓶、三角瓶以及分光光度計(jì)。實(shí)驗(yàn)所需試劑包括淀粉溶液、原碘液、稀釋碘液、糊精溶液、磷酸緩沖溶液、鹽酸溶液、以及可溶性淀粉溶液。

1.2 方法

1.2.1 比色法

首先精密稱取5.0ml 稀釋碘液將其加入50.0ml 標(biāo)準(zhǔn)容積試管內(nèi)，滴加1～2 滴糊精溶液，充分混合均勻備用。精密稱取5.0g 劑量大曲粉，經(jīng)磷酸緩沖液溶解，在40.0℃水浴裝置內(nèi)浸取120.0min，按照15.0min 的間隔時(shí)間進(jìn)行混合攪拌，確保酶液得到完全浸取，大曲自身淀粉完全消化。取上層清液置入容量瓶內(nèi)，剩余殘?jiān)旌狭姿峋彌_液研磨，所得樣品轉(zhuǎn)移至標(biāo)準(zhǔn)容積100.0ml 容量瓶內(nèi)，經(jīng)磷酸緩沖液定容至標(biāo)準(zhǔn)刻度并充分混合均勻，經(jīng)4 層紗布進(jìn)行濾過處理，保留濾液備用。取25.0ml 劑量可溶性淀粉溶液(溶液濃度為20.0g/l)以及5.0ml 劑量磷酸緩沖液，加入100.0ml 標(biāo)準(zhǔn)容積試管內(nèi)，在35.0℃水浴裝置內(nèi)保溫10.0min，視大曲溫度情況加入相應(yīng)固體曲浸出液(中溫曲的加入劑量為2.0ml，高溫曲加入劑量為20.0ml)，加入10.0ml 劑量純水，充分混合均勻后在40.0℃條件下進(jìn)行保溫，定時(shí)取反應(yīng)液1滴加入含稀釋碘液試管內(nèi)，對(duì)顏色變化進(jìn)行觀察，記錄自保溫開始至碘液顏色與標(biāo)準(zhǔn)顏色一致耗時(shí)。定義可溶性淀粉溶液用量為N，可溶性淀粉溶液濃度為n，耗時(shí)分鐘數(shù)為t1，加入固體曲浸出液體積為V，液化時(shí)間為t2，則液化力X可以用如下式(1)所示方式進(jìn)行計(jì)算：

1.2.2 分光光度法

首先精密稱取10.0g 劑量大曲粉，經(jīng)磷酸緩沖液溶解，前序處理方法與比色法一致。在此基礎(chǔ)之上精密稱取1.5g 劑量淀粉，在250.0ml 標(biāo)準(zhǔn)容積容量瓶中定容，制備濃度分別為0g/l、0.075g/l、0.15g/l、0.3g/l、0.45g/l、0.6g/l、0.9g/l 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液，吸 取1.0ml 劑量淀粉溶液加入裝有的5.0ml 劑量稀釋碘液以及0.5ml劑量鹽酸溶液試管內(nèi)，充分混合均勻，以稀釋碘液以及鹽酸溶液為空白對(duì)照，對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定，并形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取10.0ml 劑量可溶性淀粉溶液(溶液濃度為4.0g/l)、5.0ml 劑量磷酸緩沖溶液以及10.0ml 無菌水溶液，置入150.0ml 標(biāo)準(zhǔn)容積三角瓶內(nèi)，充分混合均勻后在60.0℃水浴條件條件下維持8.0min。自加入1.0ml 劑量經(jīng)稀釋待測(cè)酶液開始計(jì)時(shí)，充分混合反應(yīng)，維持10.0min。吸取1.0ml 劑量反應(yīng)液加入含5.0ml 稀釋碘液以及0.5ml 驗(yàn)算溶液試管內(nèi)，充分混合均勻，在660.0nm 檢測(cè)波長條件下對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定。定義測(cè)定酶樣濃度為c，反應(yīng)過程中加入待測(cè)定酶液量的為v，反應(yīng)時(shí)間為t，則淀粉酶活力X可以用如下式(2)所示方式進(jìn)行計(jì)算：

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時(shí)間

2.1.1 比色法

除前期準(zhǔn)備工作以外，固體曲浸出液制備耗時(shí)為120.0min，成品曲液化力會(huì)對(duì)液化時(shí)間產(chǎn)生直接影響。以高溫曲為例，按照式(1)計(jì)算所得液化力。

一般情況下，高溫曲液化力檢驗(yàn)合格標(biāo)準(zhǔn)在0.2g/g*h～0.6g/g*h 范圍內(nèi)。液化力位于底限的情況下，反應(yīng)時(shí)間為150.0min，液化力位于高限的情況下，反應(yīng)時(shí)間為50.0min。假定前期準(zhǔn)備階段以及液化期間反應(yīng)液制備耗時(shí)為30.0min，則合格曲液化力檢測(cè)時(shí)間在200.0～300.0min 范圍內(nèi)，導(dǎo)致部分液化力偏低不合格曲產(chǎn)生，造成檢測(cè)耗時(shí)較長。

2.1.2 分光光度法

除前期準(zhǔn)備工作以外，大曲粉浸提前準(zhǔn)備工作耗時(shí)為15.0min，淀粉溶液配置等相關(guān)準(zhǔn)備工作可以與酶液提取同期進(jìn)行。酶液提取耗時(shí)為150.0min，預(yù)熱反應(yīng)時(shí)間為8.0min，酶解反應(yīng)時(shí)間為10.0min，吸光度檢測(cè)時(shí)間為5.0min，因此對(duì)淀粉酶活力的測(cè)定總耗時(shí)為158.0min。由于吸光度大小會(huì)直接決定反應(yīng)底物濃度大小，因此反應(yīng)時(shí)間不受成品曲液化力因素的影響，呈相對(duì)固定的狀態(tài)。

2.2 準(zhǔn)確度

以某原料車間粉碎1#、2#高溫曲樣為實(shí)驗(yàn)樣品，分別應(yīng)用比色法以及分光光度法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，如下表(見表1、表2)所示。結(jié)合表1，經(jīng)比色法測(cè)定1#樣品液化力均值為0.43g/g*h，可作為測(cè)定真實(shí)值用于對(duì)相對(duì)誤差進(jìn)行計(jì)算，經(jīng)分光光度法測(cè)定1#樣品酶活力均值為0.58U/ml，可作為測(cè)定真實(shí)值用于對(duì)相對(duì)誤差進(jìn)行計(jì)算。對(duì)相對(duì)誤差進(jìn)行對(duì)比，1#樣品以及2#樣品比色法測(cè)定相對(duì)誤差均顯著高于分光光度法測(cè)定相對(duì)誤差，提示分光光度法對(duì)成品曲酶活力的測(cè)定準(zhǔn)確度優(yōu)于比色法。

表1 1#樣品測(cè)定結(jié)果對(duì)比

表2 2#樣品測(cè)定結(jié)果對(duì)比

3 結(jié)語

文章利用比色法以及分光光度法對(duì)大曲液化酶活力進(jìn)行測(cè)定，并就反應(yīng)時(shí)間以及測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度進(jìn)行對(duì)比，得出以下兩個(gè)方面的結(jié)論：第一，在反應(yīng)時(shí)間方面，分光光度法對(duì)大曲粉酶活力進(jìn)行檢測(cè)的反應(yīng)耗時(shí)為158.0min。而傳統(tǒng)比色法在耗時(shí)長短上直接受成品曲液化力大小的影響，合格曲液化力檢測(cè)耗時(shí)為200.0～300.0min，不合格曲液化力耗時(shí)會(huì)更長。比色法、分光光度法在檢測(cè)原理上有較高的相似性，但比色法需要等待淀粉酶將淀粉徹底酶解為藍(lán)紫色消失，而分光光度法在集中反應(yīng)10.0min 的基礎(chǔ)之上直接應(yīng)用分光光度計(jì)對(duì)試樣顏色深淺變化進(jìn)行檢測(cè)，通過評(píng)估試樣顏色消失速度的方式得到相應(yīng)的酶活力檢測(cè)數(shù)據(jù)，并以吸光度為依據(jù)對(duì)酶活力進(jìn)行計(jì)算，因此在反應(yīng)時(shí)間上較比色法更具優(yōu)勢(shì)；第二，在準(zhǔn)確度方面，比色法測(cè)定結(jié)果相對(duì)誤差顯著高于分光光度法。主要原因是比色法檢測(cè)過程中需要定時(shí)取出反應(yīng)液加入裝設(shè)有稀釋碘液的試管內(nèi)，并對(duì)顏色變化進(jìn)行觀察，測(cè)定需要間隔時(shí)間，在試樣液化力較大的情況下顏色變化速度快，時(shí)間延遲誤差無法徹底規(guī)避，肉眼觀察也可能導(dǎo)致對(duì)終點(diǎn)顏色的判斷存在誤差。由此可見，分光光度法對(duì)大曲液化酶活力進(jìn)行測(cè)定的整體效果優(yōu)于比色法，可進(jìn)一步推廣應(yīng)用。