硫酸鹽還原菌處理低濃度含鎘廢水的試驗(yàn)研究

（湖南工業(yè)大學(xué) 土木工程學(xué)院，湖南 株洲 412007）

1 研究背景

近年來(lái)，隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展、城市圈的擴(kuò)大和礦產(chǎn)資源的開發(fā)，我國(guó)流域重金屬污染日趨嚴(yán)重。以湖南省湘江流域?yàn)槔?，根?jù)相關(guān)資料[1]的統(tǒng)計(jì)，大多數(shù)有色金屬和稀有金屬礦藏的開采和冶煉主要分布在湘江流域兩岸，導(dǎo)致了土壤中重金屬污染的加劇，又由于金屬元素大多具有較強(qiáng)的遷移性，使得流域被污染后，金屬元素在水流中以離子的形式流經(jīng)被污染土壤后遷移到自然水體中。危害較大的為有色金屬，主要包括汞、鉛、鎘、銅、鉻等重金屬離子[2]。李倩[3]采用Hakanson指數(shù)法對(duì)湘江流域某研究區(qū)域土壤重金屬潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。其中一項(xiàng)結(jié)果表明，鎘在該地土壤中的富集程度最大，且具有嚴(yán)重的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)引起高度重視。

鎘（Cd）是存在于自然界中的一種金屬元素，常見的鎘化合物有氧化鎘、氯化鎘和硒化鎘等。鎘在水體中的存在形態(tài)除了簡(jiǎn)單離子，還可以與氨、氰化物、氯化物、硫酸根形成配合離子的形態(tài)存在[4]。在天然水域pH值范圍內(nèi)，水體中的鎘離子容易發(fā)生水解而生成輕基配合物和氫氧化物沉淀[5]。鎘的遷移能力強(qiáng)，容易通過吸入灰塵和植物富集進(jìn)入食物鏈，對(duì)人體造成較大危害。重金屬鎘進(jìn)入人體后會(huì)損傷神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)，引發(fā)腫瘤等[6]。

含鎘廢水屬于重金屬?gòu)U水，針對(duì)該類廢水傳統(tǒng)常規(guī)處理方法主要有電解法、離子交換法、不溶性絡(luò)合物法、沉淀法、反滲透法、氣浮法、吸附法等[7]。一般的化學(xué)沉淀法只能對(duì)高濃度污水具有較高的去除效率，并且處理后的污水容易造成二次污染。離子交換法處理含鎘廢水的凈化程度高，可以回收鎘，無(wú)二次污染，但成本較高，并且一次性交換容量有限。膜分離法、電化學(xué)法等方法雖然能有效處理低濃度重金屬?gòu)U水，但由于運(yùn)行成本較高等問題導(dǎo)致無(wú)法被大規(guī)模應(yīng)用于工程實(shí)踐中。相較于傳統(tǒng)常規(guī)處理方法，微生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、操作便利、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[8-11]。在眾多可修復(fù)重金屬污染的微生物中，硫酸鹽還原菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）是兼性厭氧的異養(yǎng)型微生物，其種類眾多且不同種類的代謝類型不同[12]，其主要處理含鎘廢水的途徑是通過SRB 在無(wú)氧呼吸過程中，將SO42-作為最終電子受體進(jìn)行異化還原[13]，從而將SO42-還原成為H2S。H2S 會(huì)與廢水中的重金屬離子反應(yīng)生成金屬硫化物沉淀，從而達(dá)到將溶解性的金屬離子從水中分離出來(lái)的目的。由于多數(shù)重金屬硫化物的溶解度很小，所以該方法可以適用于多種低濃度重金屬?gòu)U水的處理。

本研究從株洲市某污水廠的污泥中培養(yǎng)馴化出以SRB為優(yōu)勢(shì)菌種的混合菌液，以Cd2+去除率為考察指標(biāo)，考察了鎘離子初始濃度對(duì)SRB 去除含鎘廢水的影響，為SRB處理含鎘廢水的進(jìn)一步深入研究提供一定的基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 菌種

取自湖南省株洲市某污水處理廠污泥池底層污泥，呈灰黑色，顆粒粒徑均勻。

2.1.2 主要儀器與試劑

高速臺(tái)式離心機(jī)、電子天平、島津Shimadu 原子吸收發(fā)射光譜儀、UV-1800 型紫外分光光度計(jì)，均為市購(gòu)；K2HPO4和NaCl 等化學(xué)試劑均為市購(gòu)，國(guó)產(chǎn)分析純；鎘離子標(biāo)準(zhǔn)溶液參照國(guó)標(biāo)配制，所用試劑為CdCl2·2.5H2O，國(guó)產(chǎn)分析純。

2.1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g、酵母粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、水1 000 mL。富集或分離培養(yǎng)基：K2HPO4，0.01 g/L；MgSO4·7H2O，0.2 g/L；維生素C，0.1 g/L；酵母浸膏，1.0 mL/L；乳酸納，4 mL/L，pH值為7.5；NaCl，10.0 g/L；(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，10.0 g/L。

用0.1 mg/L NaOH 溶液和0.1 mg/L HCl 溶液將液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至7.5 左右，之后將培養(yǎng)基放入高壓蒸汽滅菌鍋，在121℃條件下使用高壓蒸汽滅菌20 min。由于Fe2+在高溫條件下容易被氧化，所以針對(duì)(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O 采用紫外線滅菌，滅菌后放置備用，等液體培養(yǎng)基降至室溫后再加入。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 菌株的篩選分離與純化

將取樣的污泥分裝在錐形瓶中，按每升加入5 g無(wú)水硫酸鈉，在35℃下振蕩培養(yǎng)馴化1 周。然后將其接入液體富集培養(yǎng)基進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，大約2～3 d后，錐形瓶中氧氣耗盡，形成厭氧環(huán)境，培養(yǎng)基顏色變黑（FeS所致）。打開錐形瓶封口膜，可聞到濃烈的臭雞蛋氣味（H2S），將打濕的醋酸鉛試紙置于瓶口位置進(jìn)行檢測(cè)，變黑，說(shuō)明培養(yǎng)基中含有SRB。每周將10 mL 菌液接種至新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)4 周后獲得以SRB為優(yōu)勢(shì)菌種的混合菌液。即可采用稀釋涂布-夾層培養(yǎng)法進(jìn)行厭氧分離培養(yǎng)[14]。

2.2.2 菌株對(duì)鎘離子的耐受性試驗(yàn)

參考D.Teclu 等的試驗(yàn)方法[15]，將富集后的SRB 混合菌液在厭氧條件下培養(yǎng)50 h。然后，在無(wú)菌條件下，取50 mL 菌液，在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min 下離心8 min。舍去上清液，用2.5 g/L的NaHCO3溶液對(duì)離心管底部的菌體沉積物進(jìn)行稀釋，控制OD（optical density，OD）值在0.1 左右，各接種10 mL 于5個(gè)250 mL 液體培養(yǎng)基中。密閉封口，并用體積分?jǐn)?shù)為99.99%的N2吹托這4個(gè)錐形瓶10 min，放入恒溫培養(yǎng)箱中于35℃下培養(yǎng)12 h后（此時(shí)無(wú)H2S 生成），用移液管加入用CdCl2·2.5H2O 配置好的Cd2+溶液，使培養(yǎng)基內(nèi)Cd2+的質(zhì)量濃度分別為10,20,40,60,80 mg/L，并且于7d取樣后置于離心機(jī)中于3 000 r/min 下離心10 min。取上清液用微孔濾膜（孔徑為0.22 μm）過濾，經(jīng)酸化-消化處理后稀釋不同倍數(shù)，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定剩余Cd2+的質(zhì)量濃度。

2.2.3 菌株處理鎘離子的去除效果試驗(yàn)

取厭氧培養(yǎng)50 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SRB 混合菌液，在無(wú)菌條件下取50 mL 菌液在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min下離心8 min。舍去上清液，再用濃度為2.5 g/L的NaHCO3溶液對(duì)離心管底部的菌體沉積物進(jìn)行稀釋，控制OD值在0.1 左右，在1個(gè)250 mL 液體培養(yǎng)基中接種10 mL，密閉封口，放入恒溫培養(yǎng)箱中于35℃下培養(yǎng)12 h后，加入初始質(zhì)量濃度為20 mg/L Cd2+溶液。同上述方法取樣并測(cè)定剩余Cd2+的濃度。按下式計(jì)算菌體對(duì)Cd2+的去除率：

式中C0和Cf分別為鎘離子的起始質(zhì)量濃度和最終質(zhì)量濃度(mg/L)。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌液對(duì)Cd2+耐受性試驗(yàn)

根據(jù)2.2.2節(jié)的試驗(yàn)步驟，打開瓶口密封膜對(duì)瓶?jī)?nèi)氣味進(jìn)行鑒別，考察7 d后耐受試驗(yàn)中各濃度梯度下錐形瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基表觀變化情況，以此判斷該試驗(yàn)條件下SRB 對(duì)Cd2+的耐受性，結(jié)果如表1所示。

表1 不同質(zhì)量濃度梯度下的培養(yǎng)基變化Table1 Changes of culture medium under different mass concentration gradients

從表1的結(jié)果可知，在培養(yǎng)基中Cd2+的質(zhì)量濃度低于40 mg/L時(shí)，7 d后錐形瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基會(huì)變黑，打開瓶口密封膜會(huì)散發(fā)出濃烈的臭雞蛋氣味。當(dāng)培養(yǎng)基中Cd2+的質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg/L 以上時(shí)，7 d后錐形瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基無(wú)顏色變化，打開瓶口密封膜瓶?jī)?nèi)無(wú)明顯臭雞蛋氣味。該結(jié)果初步說(shuō)明當(dāng)培養(yǎng)基中Cd2+的質(zhì)量濃度低于40 mg/L時(shí)，對(duì)SRB的正常生長(zhǎng)代謝無(wú)明顯影響，當(dāng)培養(yǎng)基中Cd2+濃度達(dá)60 mg/L 以上時(shí)，SRB的生長(zhǎng)代謝受到明顯影響。相關(guān)資料[16]顯示，低濃度的重金屬可刺激微生物生長(zhǎng)，而高濃度的重金屬可抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，損害其呼吸作用，使細(xì)胞形態(tài)異常，甚至裂解。SRB可以通過細(xì)胞的主動(dòng)吸收并積存重金屬在細(xì)胞的原生質(zhì)內(nèi)，從而降低重金屬的毒害作用，但重金屬離子超過了自身的耐受性也會(huì)使SRB的代謝生長(zhǎng)受到抑制[17]。黃志等[18]研究發(fā)現(xiàn)，隨著重金屬離子初始濃度的升高，SRB 對(duì)于Cu2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Fe2+各重金屬離子的去除率均降低，當(dāng)Cd2+的初始質(zhì)量濃度達(dá)50 mg/L后，重金屬對(duì)SRB的抑制作用開始顯現(xiàn)。

去除率是考察SRB 在不同環(huán)境下去除能力的指標(biāo)，7 d后課題組對(duì)培養(yǎng)基內(nèi)Cd2+質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，并依照2.2.3中的公式計(jì)算SRB 對(duì)Cd2+的去除率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同初始質(zhì)量濃度下SRB 對(duì)Cd2+的去除率Fig.1 Removal rate of Cd2+ by SRB under different initial mass concentrations

從圖1中可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中Cd2+的質(zhì)量濃度低于40 mg/L時(shí)，SRB 對(duì)于Cd2+的去除率接近100%；當(dāng)培養(yǎng)基中Cd2+的質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg/L 以上時(shí)，SRB 對(duì)于Cd2+的去除率較低。試驗(yàn)結(jié)果從另一方面說(shuō)明當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境的Cd2+濃度超出SRB 耐受性時(shí)，會(huì)對(duì)菌體的正常代謝生長(zhǎng)有較為明顯的抑制作用，從而降低其去除效果。而觀察到高質(zhì)量濃度（60，80 mg/L）Cd2+條件下，Cd2+的去除率也有所下降，其原因可能是細(xì)胞的直接吸附作用，也有可能是細(xì)胞受到Cd2+劇毒性裂解后的死菌體所具有的吸附作用，它能夠通過吸附作用為SRB 去除溶液中的高濃度重金屬離子做出一定的貢獻(xiàn)，金顯春[19]在研究微生物法除砷時(shí)，將試驗(yàn)所用的煙曲霉菌球經(jīng)過高溫殺菌后，制成吸附劑，并通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該吸附劑對(duì)As (III)和As (V) 均有著良好的吸附效果。可以推斷，本試驗(yàn)所培養(yǎng)馴化的SRB 菌對(duì)于Cd2+耐受極限應(yīng)在40～60 mg/L，這與參考文獻(xiàn)[18]中所得結(jié)論（50 mg/L）較為吻合，說(shuō)明該菌適用于低濃度Cd2+廢水的處理。

3.2 菌液對(duì)Cd2+去除效果的試驗(yàn)

SRB 能否達(dá)到應(yīng)用中解決含鎘廢水的問題，還需研究其在不同濃度下對(duì)于Cd2+的去除效果。在2.1節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，研究通過試驗(yàn)測(cè)定不同初始質(zhì)量濃度（10,20,40,60 mg/L）下SRB 菌液對(duì)Cd2+的處理效果，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同初始質(zhì)量濃度下經(jīng)SRB 作用后廢水中Cd2+質(zhì)量濃度的變化曲線Fig.2 Variation of residual concentration of Cd2+ in wastewater after SRB treatment under different initial mass concentrations

從圖中2可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)Cd2+溶液的質(zhì)量濃度為60 mg/L時(shí)，SRB 對(duì)Cd2+幾乎沒有去除效果，在1～2 d 內(nèi)有部分Cd2+濃度下降。當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)Cd2+的質(zhì)量濃度低于40 mg/L時(shí)，在SRB 生長(zhǎng)的各個(gè)階段對(duì)于Cd2+都有較高的去除效果，SRB可以完全去除培養(yǎng)基中的Cd2+，去除率接近100%。在整個(gè)過程中，Cd2+質(zhì)量濃度隨反應(yīng)時(shí)間而不斷下降，培養(yǎng)基內(nèi)的Cd2+質(zhì)量濃度在反應(yīng)的前4 d 下降得最快，此后下降的速度趨于緩慢。這符合微生物生長(zhǎng)的規(guī)律，SRB在經(jīng)過一段時(shí)間的適應(yīng)期后，在對(duì)數(shù)期的去除能力突出，去除率在其對(duì)數(shù)期達(dá)到最高值，其次為穩(wěn)定期，該結(jié)果與董靜等[20]的研究結(jié)果相符。有學(xué)者在研究SRB處理含鈾廢水時(shí)，發(fā)現(xiàn)利用以SRB為優(yōu)勢(shì)菌種的混合菌液在延滯期和對(duì)數(shù)期對(duì)于U(Ⅵ)的處理效果較好[21]。

進(jìn)一步分析SRB處理Cd2+的效果隨時(shí)間的變化規(guī)律，以更好地在高效處理時(shí)間內(nèi)利用SRB的去除能力解決含鎘廢水治理問題。課題組單獨(dú)研究了Cd2+初始濃度為20 mg/L時(shí)，不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)SRB 對(duì)Cd2+的去除效果，結(jié)果如圖3所示。

圖3 初始質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)SRB 對(duì)Cd2+的去除效果隨時(shí)間的變化曲線Fig.3 Time depondent of Cd2+ removal rate by SRB with an initial mass concentration of 20 mg/L

從圖3中可以看出，向培養(yǎng)基中加入20 mg/L的Cd2+溶液后，前4 d 去除的效果達(dá)到了94%，說(shuō)明在整個(gè)7 d的處理過程中，SRB 前4 d的處理效果占據(jù)了重要地位。隨著時(shí)間的增加，SRB 對(duì)于Cd2+的去除速率（單位時(shí)間內(nèi)的去除率）逐漸降低，一方面可能與菌株的生長(zhǎng)規(guī)律有關(guān)，另一方面可能是與菌液中的硫酸根離子濃度下降有關(guān)[22]。菌株在衰亡期對(duì)硫酸根離子的還原速率變慢，其次，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，底物硫酸根離子的濃度減少。

SRB 對(duì)于各種重金屬離子的去除機(jī)理一直是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，潘響亮[23]等通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原菌群分泌的胞外聚合物對(duì)Cu2+也有一定的吸附效果。本研究對(duì)反應(yīng)后瓶底的沉積物進(jìn)行了觀察與分析，判斷SRB 去除Cd2+反應(yīng)過程中的機(jī)理。圖4為7 d后用于系統(tǒng)反應(yīng)的錐形瓶底部的沉淀物圖像。

圖4 不同初始質(zhì)量濃度下錐形瓶底部沉淀物圖像Fig.4 Sediment images at the bottom of the conical flask under different initial mass concentrations

從圖4中可以觀察到，10～40 mg/L的3個(gè)錐形瓶底部有大量明顯的黑色沉淀物，經(jīng)初步分析為CdS沉淀。由此可以得出，在SRB 菌株生長(zhǎng)較好時(shí)，對(duì)Cd2+的去除途徑中H2S 占據(jù)了主導(dǎo)地位，其機(jī)理就是通過SRB 還原產(chǎn)生的H2S 反應(yīng)生成CdS 沉淀而得以去除。含有60 mg/L的Cd2+溶液的錐形瓶底部有少量暗黃色沉淀物，猜測(cè)沉淀物為少量CdS與死菌體的混合物。

結(jié)合3.1節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，分析SRB 菌株在耐受性范圍以外的生長(zhǎng)狀況，可以進(jìn)一步掌握SRB處理含鎘廢水的條件，在Cd2+初始質(zhì)量濃度為60 mg/L的情況下，SRB 對(duì)其幾乎沒有處理效果，過高的Cd2+濃度會(huì)抑制SRB的還原過程，甚至對(duì)細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生很大的損傷作用。相關(guān)資料[24]表明，重金屬離子的劇毒性會(huì)導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)部的過度氧化和選擇性損傷。它們和細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分的必要金屬競(jìng)爭(zhēng)含內(nèi)部硫化合物和氧的結(jié)合位點(diǎn)，從而破壞DNA 鏈和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，干擾細(xì)胞代謝中正常的氧化磷酸化[25]，從而使微生物死亡。

4 結(jié)論與展望

利用生物技術(shù)對(duì)環(huán)境進(jìn)行修復(fù)興起于21世紀(jì)，在治理重金屬污染方面有很大的應(yīng)用前景，關(guān)于含鎘廢水的處理目前有很多。安毅夫[26]利用硫酸鹽還原菌和解磷菌聯(lián)合修復(fù)Cd 污染土壤，修復(fù)效率為73.96%。趙美花等[27]利用黃孢原毛平革菌處理鎘污染廢水，在最佳處理?xiàng)l件下，對(duì)鎘的去除率可達(dá)64% 左右。本研究利用從污水處理廠污泥池中分離得到的以SRB為優(yōu)勢(shì)菌種的混合菌液處理低濃度含鎘廢水。

在適宜的環(huán)境條件下，SRB 對(duì)Cd2+的耐受極限應(yīng)為40～60 mg/L，有研究表明，SRB的耐受性可以通過有效途徑提高，田玉斌等[28]通過采用聚乙烯醇-硼酸二次交聯(lián)的方式，制作了新型硫酸鹽還原菌生物活性填料，SRB 被包裹在包埋填料中，提升了SRB對(duì)于重金屬的耐受程度。此外，可以通過馴化的方式來(lái)提高微生物的耐受性，葉錦韶等[29]認(rèn)為在微生物的生長(zhǎng)環(huán)境中含有一定濃度的某類重金屬時(shí),可有效地誘導(dǎo)出微生物體內(nèi)對(duì)重金屬的運(yùn)輸與毒性起到拮抗與解毒作用的抗性基因。

初始質(zhì)量濃度低于40 mg/L的含鎘廢水可以被SRB 完全去除，并且處理效果可以達(dá)到國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)。從沉淀底物CdS可以說(shuō)明將SO4-還原為S2-從而與重金屬離子形成沉淀，是SRB 去除重金屬的主要途徑。

在最佳的反應(yīng)條件下Cd2+的去除率接近100%，效果比較理想，說(shuō)明利用SRB處理含鎘廢水具有一定的可行性，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)可以為SRB處理低濃度含鎘廢水提供一定的基礎(chǔ)參數(shù)支撐。由于微生物本身的處理機(jī)制和實(shí)驗(yàn)條件的不同，如菌液投加濃度、pH值和溫度等因素的影響，不同微生物對(duì)不同重金屬離子的去除效果存在一定差異。

反應(yīng)過程中菌液pH值的變化與SRB 還原SO4-為S2-形成CdS沉淀的關(guān)系是本試驗(yàn)有待解決的問題，以及菌體裂解后高濃度Cd2+廢水濃度仍有所下降的原因也有一定的研究空間。同時(shí)，不同的地區(qū)有著不同的環(huán)境條件，相較于實(shí)驗(yàn)室研究有很大的差異，如何結(jié)合實(shí)際開展實(shí)際的治理應(yīng)用具有更深遠(yuǎn)的研究意義。