外泌體在婦科腫瘤中的研究與應用進展

王 博 王 超

外泌體(exosomes)是細胞釋放的一種納米級囊性結(jié)構(gòu)，直徑為30～150 nm，廣泛存在于血液、腹水、陰道宮腔灌洗液等體液中。外泌體通過轉(zhuǎn)運核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體等內(nèi)容物，調(diào)控細胞間交流，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、微環(huán)境形成和免疫調(diào)控等方面起重要作用。

1 外泌體在腫瘤中的研究與應用

外泌體的內(nèi)容物可涵蓋蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)體等，內(nèi)容物的多樣性決定了其豐富的功能。外泌體可在細胞間傳遞功能性內(nèi)容物，介導細胞間的信息交流，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。外泌體影響腫瘤的功能具體表現(xiàn)為促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移、影響腫瘤微環(huán)境[1]、影響腫瘤免疫調(diào)控等。外泌體對腫瘤細胞增殖的影響具有兩面性。一方面，腫瘤細胞以外泌體形式排出細胞內(nèi)的腫瘤抑制因子，維持其生長。例如，膀胱癌細胞釋放含有腫瘤抑制因子的外泌體，使細胞內(nèi)抑制因子含量減少，抑制功能減弱，導致腫瘤增殖進程加快；沉默RAB27A、RAB27B基因的表達可抑制上述外泌體釋放，抑制腫瘤細胞增殖[2]。這提示腫瘤細胞的增殖過程可被逆轉(zhuǎn)。另一方面，腫瘤細胞可以通過接受其他細胞來源的外泌體活化下游生長信號通路，促進腫瘤細胞增殖。外泌體通過轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)和核酸等內(nèi)容物激活相關信號通路，增強腫瘤細胞侵襲性。外泌體還可以影響細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、細胞間信息交流，以及通過自分泌或旁分泌等方式調(diào)節(jié)腫瘤細胞的侵襲特性。例如，肝癌細胞外泌體通過轉(zhuǎn)移賴氨酰氧化酶樣4(LOXL4)蛋白質(zhì)，激活黏著斑激酶/類固醇激素受體(FAK/Src)途徑，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[3]。從激活的免疫細胞中提取的外泌體，可以通過多種細胞毒性蛋白質(zhì)和殺傷機制作用于特定的腫瘤細胞，并抑制其轉(zhuǎn)移[4]。

外泌體包含豐富的內(nèi)容物，具有廣泛的應用價值。例如，外泌體內(nèi)的核酸分子——微RNA(miRNA)、脫氧核糖核酸(DNA)等，可決定細胞的表觀特性。目前，部分臨床研究已實現(xiàn)通過檢測外泌體內(nèi)核酸分子表達，進行腫瘤的早期診斷。此外，腫瘤細胞產(chǎn)生的外泌體包含大量的蛋白質(zhì)，例如LOXL4蛋白質(zhì)[3]、神經(jīng)細胞黏附分子CD171[5]、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)[6]等，這些蛋白質(zhì)可以作為治療靶點，使納米級分子藥物的靶向治療成為可能。

2 外泌體在婦科腫瘤中的研究進展

目前，外泌體在婦科腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用備受關注，相關研究主要聚焦于腫瘤細胞發(fā)生和發(fā)展、腫瘤細胞微環(huán)境調(diào)控、免疫調(diào)控等。

2.1 外泌體與婦科腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移 外泌體對婦科腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移的影響，主要取決于其內(nèi)部所包含的核酸分子和蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能。卵巢癌分泌的外泌體中酪氨酸蛋白激酶受體(EphA2)含量較高，通過磷酸化機制富集EphA2，引起EphA2與其配體ephrin-A1的反向信號傳導，促進腫瘤細胞增殖[7]。CD171作為細胞遷移誘導物，可觸發(fā)細胞外信號激酶磷酸化，借助外泌體的運輸而增加卵巢癌細胞的侵襲性，與卵巢癌的不良預后密切相關[5]。外泌體內(nèi)整聯(lián)蛋白質(zhì)可促進細胞外基質(zhì)中纖連蛋白的黏附、組裝，從而增強腫瘤細胞極化狀態(tài)，促進腫瘤細胞的定向黏附運動[8]。MMP1的表達與卵巢癌不良預后密切相關，高轉(zhuǎn)移性卵巢腫瘤細胞分泌的外泌體可使間皮細胞中MMP1表達量顯著升高，促進間皮細胞凋亡，從而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[5]。核酸是可影響腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的另一種外泌體內(nèi)容物。當外泌體攜帶的核酸分子是腫瘤抑制因子時，該核酸分子可以成為潛在的預后判斷指標。子宮內(nèi)膜癌細胞分泌的外泌體miRNA-148b，可以抑制腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移，當外泌體缺失miRNA-148b時，子宮內(nèi)膜癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的風險增加[9]。所以，外泌體通過轉(zhuǎn)移其內(nèi)容物而影響腫瘤細胞侵襲能力的機制或可成為研究腫瘤治療手段的主要方向，外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)與核酸分子間的相互作用機制亦值得進一步研究。

腫瘤微環(huán)境在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，腫瘤細胞及其周圍細胞分泌的細胞因子等均可影響腫瘤細胞的生物學行為。腫瘤來源的外泌體可促進骨髓干細胞表達促血管生成表型，依賴“歸巢行為”趨向地遷移至靶組織血管床，促進腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[10-12]。卵巢癌來源的外泌體miRNA-21抑制卵巢癌細胞凋亡，阻斷內(nèi)皮細胞釋放外泌體miRNA-21，誘導新生血管形成[13-14]。宮頸癌分泌的外泌體通過血管生成抑制蛋白 1(VASH1)通路，促使淋巴管生成，促進腫瘤細胞的淋巴轉(zhuǎn)移[15]。子宮內(nèi)膜癌外泌體將短發(fā)夾樣RNA(shRNA)傳遞給子宮內(nèi)膜的成纖維細胞，改變成纖維細胞內(nèi)功能性miRNA表達譜[16]。進一步研究[17]發(fā)現(xiàn)，miRNA-148b直接結(jié)合下游靶基因DNMT1，阻止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，提示腫瘤微環(huán)境在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，揭示了治療子宮內(nèi)膜癌潛在的靶點。多發(fā)性骨髓瘤細胞攜帶的Piwi相互作用RNA 823(piRNA-823)可對微環(huán)境內(nèi)的內(nèi)皮細胞進行“再教育”，以改變腫瘤細胞增殖、侵襲等生物學特性[18]。

此外，細胞通過釋放或吸收不同來源的外泌體，調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移前生態(tài)微環(huán)境形成，發(fā)揮促血管和淋巴管生成、促成纖維細胞和間質(zhì)細胞分化、重塑細胞外基質(zhì)、調(diào)控內(nèi)皮細胞等作用，影響腫瘤細胞的侵襲性。

2.2 外泌體與婦科腫瘤免疫 腫瘤發(fā)生過程中往往產(chǎn)生腫瘤抗原，激發(fā)免疫反應。在婦科腫瘤免疫中，腫瘤細胞來源的外泌體通常有促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，而免疫細胞來源的外泌體則協(xié)助多種免疫細胞殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

在卵巢癌中，巨噬細胞和T淋巴細胞群均可受外泌體調(diào)控。上皮性卵巢癌釋放的外泌體可以激活巨噬細胞的“促腫瘤增殖”表型[19]，同時，巨噬細胞釋放的外泌體內(nèi)容物miRNA-223可使卵巢癌細胞產(chǎn)生對化學治療藥物的耐藥表型[20]。卵巢癌相關巨噬細胞外泌體中富集的miRNA-29a-3p和miRNA-21-5p導致調(diào)節(jié)性與輔助性T淋巴細胞17(Treg/Th17)細胞群失衡[21]。在卵巢癌患者血清和腹膜液中的外泌體內(nèi)容物miRNA-1246大量表達，miRNA-1246可操控腫瘤微環(huán)境中M2型巨噬細胞表型，促進腫瘤生成。研究者利用癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，高表達miRNA-1246的卵巢癌患者總體預后更差。在動物實驗中，抑制外泌體中的miRNA-1246并結(jié)合化學治療，可提高卵巢癌細胞對紫杉醇的藥物敏感性，降低小鼠體內(nèi)的腫瘤負荷[22]，提示外泌體可作為體液免疫治療和腫瘤耐藥治療的靶點。

研究[23-24]結(jié)果證實，外泌體中小型熱休克蛋白質(zhì)(sHSP)與腫瘤免疫相關。在子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌患者的血清和腹膜液中提取外泌體后發(fā)現(xiàn)其中的sHSP的表達量增加，且與細胞毒性免疫反應標志物的表達水平呈正相關。早前研究發(fā)現(xiàn)，sHSP在小鼠模型中可誘導抗腫瘤免疫反應[23]，抗癌藥物可促進肝癌細胞通過外泌體釋放sHSP[24]，上述研究提示外泌體可在動物實驗和體外介導自然殺傷細胞的抗腫瘤反應。

在宮頸癌動物模型上驗證樹突狀細胞來源的外泌體(dendritic cell derived exosone,DEXO)可以引發(fā)體內(nèi)外抗腫瘤的免疫反應。負載E749-57肽的DEXO能有效促進體外CD8+T淋巴細胞增殖，誘導細胞毒活性，促進IFN分泌。此外，DEXO作為疫苗在體外可促進抗原E7誘導的免疫小鼠脾細胞的免疫應答。值得注意的是，DEXO介導的宮頸癌保護性免疫應答，可以被聚肌胞苷酸誘導，在顯著抑制腫瘤生長的同時，提高宮頸癌模型動物的存活率[25]。

外泌體在婦科腫瘤的免疫中有雙向作用，對調(diào)控機制的進一步研究有助于理解外泌體在腫瘤免疫中的雙重角色。

3 外泌體在婦科腫瘤診治中的應用

3.1 診斷 在婦科腫瘤細胞分泌的外泌體中，部分核酸和蛋白質(zhì)具有診斷價值，甚至與疾病的臨床分型相關。與健康人群相比，卵巢癌患者腹水和腹膜液來源的外泌體中，發(fā)現(xiàn)有5種mRNA(CA11、MEDAG、LAMA4、SPINT2、NANOG)和6種miRNA(let-7b、miRNA-23b、miRNA-29a、miRNA-30d、miRNA-205、miRNA-720)的表達存在差異；而卵巢漿液性腺癌患者來源的外泌體表現(xiàn)為miRNA-30a-5p的富集[26-28]。有研究[3, 5]發(fā)現(xiàn)，CD171、MMP1的表達與卵巢癌患者的不良預后相關。一種簡單的微流體方法(ExoSearch)可檢測卵巢癌患者血漿中3種外泌體來源的腫瘤標志物(CA125、EpCAM、CD24)表達，其診斷的靈敏度和特異度與標準Bradford測定法的效果相當[29]。在宮頸癌患者的宮頸陰道灌洗液標本來源的外泌體中，miRNA-21和miRNA-164a表達水平明顯升高，促轉(zhuǎn)錄因子ATF1和RAS基因的表達明顯上調(diào)，HOTAIR、MALAT1、MEG3這3種長鏈非編碼RNA水平明顯升高[30-32]。在子宮內(nèi)膜癌患者尿液來源的外泌體中，多個miRNA譜系較正常樣本有所改變，而hsa-miRNA-200c-3p明顯富集，是有意義的診斷靶點[33]。從子宮內(nèi)膜灌洗液中提取的外泌體人集聚蛋白CD81、CLD6、RAB8A可有效地進行子宮內(nèi)膜癌的早期診斷和疾病分層[9]，提示外泌體內(nèi)容物在婦科腫瘤的早期診斷中具有潛力，可在臨床上進一步開展新型、無創(chuàng)、個體化診斷。

3.2 治療 關于外泌體與婦科腫瘤的研究多聚焦于卵巢癌，涉及藥物載體、生物裝置、光動力療法和腫瘤細胞的化學治療耐藥性等方面，外泌體在臨床試驗中還可作為新的檢測手段和治療方法。

外泌體作為藥物載體具有良好的轉(zhuǎn)運特性、循環(huán)穩(wěn)定性和靶向性，相關研究[34]描述了靶向致癌基因KRAS的外泌體生產(chǎn)及其質(zhì)量檢測流程，并提出大規(guī)模生產(chǎn)治療型外泌體的展望。婦科腫瘤常用的化學治療藥物，如多柔比星、紫杉醇，可通過電穿孔、聲波促融合等方式被裝載入外泌體，穩(wěn)定地發(fā)揮治療效果[35-36]。在生物裝置中，嵌入小鼠腹部三維(3D)支架內(nèi)的腫瘤外泌體可以模擬轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，捕獲腹膜內(nèi)卵巢腫瘤細胞，避免腫瘤進展、轉(zhuǎn)移[37]，這一發(fā)現(xiàn)為卵巢癌的治療提供新思路。美國加州腫瘤研究中心利用特殊透析裝置吸附外泌體表面抗原、抗體，清除循環(huán)血液中的外泌體，并證實不同級別卵巢癌患者血液中的外泌體可以被有效過濾[38-39]。5-氨基酮戊酸光動力療法(ALA-PDT)可抑制miRNA-34a在細胞內(nèi)的表達，介導含有高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的外泌體釋放，從而促進人乳頭瘤病毒(HPV)陽性的宮頸癌細胞凋亡，抑制其增殖[38]。

外泌體內(nèi)容物與腫瘤耐藥性密切相關。基質(zhì)細胞外泌體miRNA-21靶向于卵巢癌APAF1 基因，缺氧刺激下巨噬細胞外泌體將miRNA-223轉(zhuǎn)移至卵巢癌細胞，上述機制可觸發(fā)卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥性[40-41]。含有CRISPR/Cas9的外泌體也可引起卵巢癌細胞對順鉑的耐藥性[42]。進一步觀察臨床樣本，發(fā)現(xiàn)循環(huán)外泌體miRNA-223水平與卵巢癌的復發(fā)率呈正相關，與人第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)-磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路激活有關[43]，提示阻斷相關外泌體的釋放，可改變卵巢癌耐藥性，亦可通過測定相關外泌體含量評估化學治療效果。

在臨床試驗中，外泌體同樣應用廣泛。在直腸癌、前列腺癌、乳腺癌(臨床試驗注冊號分別為NCT01294072、NCT02702856、 NCT03974204)等實體瘤中，運用外泌體進行診斷檢測、疾病分型、藥物裝載等研究可使患者的診斷、治療流程更加高效、便捷。對子宮內(nèi)膜癌外泌體(NCT02797834)和卵巢癌外泌體(NCT03738319)的臨床研究正在開展，相關試驗主要研究外泌體特性及其內(nèi)容物在疾病生理病理過程中的作用。上述臨床試驗均在http://www.clinicaltrials.gov網(wǎng)站備案。

通過外泌體攜帶藥物或外泌體生物裝置抑制腫瘤細胞，或利用光動力療法抑制腫瘤相關外泌體生成，或抑制腫瘤細胞耐藥外泌體生成，均為靶向外泌體的治療拓寬了新思路。外泌體相關臨床試驗也正有序開展，外泌體有望實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，提示了外泌體在臨床應用中的巨大前景。

3.3 其他應用 外泌體在術后康復和腫瘤疫苗應用方面的研究也有相關報道。間質(zhì)細胞來源的外泌體將miRNA-125a轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細胞，抑制Delta樣配體4(DLL4)的表達，促進正常的血管形成[43]，提示外泌體具有促進術后康復的作用。然而，其促血管生成作用可能加快術后殘留腫瘤細胞的侵襲進展，外泌體促血管生成的作用機制尚未明確，有待進一步研究。DEXO產(chǎn)生抗宮頸癌細胞的免疫應答，是新型宮頸癌疫苗接種應用的研究方向[25]。關于外泌體相關卵巢癌疫苗和子宮內(nèi)膜癌疫苗的研究報道較少。

4 展 望

外泌體內(nèi)豐富的內(nèi)容物可影響腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移，以及調(diào)控腫瘤微環(huán)境，故外泌體具有較高的臨床應用價值。但是，目前對于外泌體內(nèi)容物及其機制的研究主要聚焦于miRNA方向，外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)的功能還有待進一步明確。外泌體的臨床應用前景較為樂觀，特別是作為生物學標志物在相關體液活檢的應用方面更具潛力。目前部分檢測方法技術要求較高，外泌體內(nèi)容物復雜，不適用于臨床檢測的實際需求，須尋找更多具有診斷價值的靶向分子。雖然外泌體相關的新興治療手段多樣，但在外泌體中高效裝載治療分子暫時難以實現(xiàn)，同時，外泌體在體內(nèi)環(huán)境的藥理學變化尚未得到確切描述。此外，外泌體在婦科三大惡性腫瘤(卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌)中的增殖、轉(zhuǎn)移調(diào)控機制未完全明確，仍待進一步研究。