循環(huán)微RNA參與靜脈血栓栓塞的形成機制及其診斷價值

彭 玲 周 超

靜脈血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)是僅次于卒中和心肌梗死的第三大心、腦血管疾病，主要包括深靜脈血栓栓塞(deep venous thrombosis，DVT)和肺栓塞(pulmonary embolism， PE)，主要病理學表現(xiàn)為血液凝固并形成栓子，使血管完全或不完全堵塞。目前，普遍觀點認為其主要發(fā)病機制為血管壁損傷、血流動力學改變和血液成分變化，而長期制動、手術、創(chuàng)傷、妊娠、產褥期、癌癥等為其主要高危因素[1]。

VTE的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，常難以得到及時準確的診斷，因而易延誤病情。此外，目前臨床普遍使用的血漿生物學標志物D-二聚體的水平會隨著年齡的增長而升高；因此，對所有年齡的人群均采用500 μg/L作為界限值的臨床效用較低，故以D-二聚體陰性作為VTE的排除標準仍存在一定的假陰性(7%左右)[2]。而有“金標準”之稱的血管造影，因造影劑對心血管、腎臟有損害作用，以及其技術要求高或臨床禁忌證較多而導致應用受限。因此，尋找一項具有高靈敏度與高特異度的生物學標志物來輔助診斷VTE有較大的臨床意義[3]。

微RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為21～25個核苷酸的內源性非編碼RNA。最初在細胞核內合成初始RNA,繼而由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，核糖核酸酶Ⅲ(Drosha)切割，產生的miRNA被轉運到細胞質中，由核糖核酸酶Ⅲ(Dicer)加工成雙鏈miRNA。其中一條雙鏈代表成熟的miRNA，并被組裝成RNA誘導的沉默復合物(RISC)，而另一條雙鏈則被降解，整合到RISC中的miRNA即可通過抑制、誘導或降解信使RNA(mRNA)調控翻譯而影響機體病理生理功能，在細胞分化、增殖、代謝、衰老、凋亡等生物學現(xiàn)象中起著至關重要的作用，從而參與機體在各種疾病中的病理過程，并促進其發(fā)展[4]。miRNA可穩(wěn)定存在于血漿微粒體和外泌體中，或與蛋白質結合為復合物，以保護miRNA不被降解。在過去的幾年里，血漿和血清miRNA譜被廣泛地用于疾病(如心肌梗死、動脈粥樣硬化、心力衰竭、腫瘤等)的診斷和預后的預測中。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA可影響血小板相關蛋白、組織因子，以及血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)的表達,從而在血栓形成與止血過程中發(fā)揮重要作用[5-6]，然而，目前對miRNA在靜脈血栓形成中的作用尚處于探索階段，關于其與PE的聯(lián)系也僅限于一些小樣本量的研究。

1 miRNA與血栓形成

血栓形成是指在一定條件下，循環(huán)血液中的有形成分在血管內形成栓子，造成血管部分或完全堵塞，使得相應部位血供障礙的病理過程。若栓塞持續(xù)存在，則可導致組織和器官壞死。一般情況下，血栓以壞死、機化或溶解再通為結局，其中血栓溶解類似于傷口愈合過程中肉芽組織的形成，是指血栓內新生血管通道形成的生物過程[7]。

1.1 miRNA與EPC EPC作為血管內皮修復過程中的一個重要因素，在機體缺血時可從骨髓中動員到外周循環(huán)，遷移并結合到內皮剝脫處或新生血管部位，促進缺血器官的修復。自Modarai等[8]首次證明了EPC對血栓具有治療作用以來，越來越多的證據(jù)表明，內皮細胞在血管新生方面發(fā)揮著重要作用。EPC不僅可對抗持續(xù)危險因子引起的內皮細胞損傷，而且可結合并替代功能失調的內皮細胞[9]。

miRNA-126(miR-126)是血管內皮細胞中常見的miRNA，在維持內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成過程中起著重要的作用[10]。 研究[11]證實，敲除斑馬魚的miR-126可導致其胚胎發(fā)育過程中發(fā)生血管完整性喪失和出血。同樣，miR-126敲除,小鼠也可發(fā)生血管完整性缺陷、出血和部分胚胎死亡[12]。近期，在一項關于miR-126對EPC功能和靜脈血栓溶解影響的研究中，通過對轉染miR-126模擬物的EPC進行創(chuàng)面愈合試驗與遷移試驗后發(fā)現(xiàn)，增加miR-126的表達可增強體外EPC的遷移能力;在管腔形成實驗中，miR-126模擬物轉染組與對照組也存在明顯的差異(P<0.05)，表明miR-126可促進管腔形成、EPC在體內的歸巢和血栓溶解;同時,敲除磷酸肌醇-3激酶調節(jié)亞基2(PIK3R2),并通過Western印跡等實驗方法證實，抑制PIK3R2的表達可促進EPC的功能，表明PIK3R2是miR-126作用的靶基因[13]。在構建小鼠下腔靜脈血栓模型的基礎上，體外培養(yǎng)EPC并提取內皮衍生外泌體，用攜帶miR-126與不攜帶miR-126的外泌體分別對模型小鼠進行處理，并通過組織病理學檢查比較兩者對于靜脈血栓的治療效果，結果發(fā)現(xiàn)攜帶miR-126的外泌體顯著促進了模型動物血栓溶解，體外實驗同樣證實轉染miR-126的外泌體增強了EPC在體外遷移的能力[14]。

miRNA-424(miR-424)則可通過靶向作用于成纖維細胞生長因子受體1(FGFR-1)和血管內皮生長因子受體2(VEGFR-2)來調節(jié)內皮細胞的促血管生成功能,即miR-424的過表達可減少內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成[15]。另一項基于小鼠靜脈血栓模型的研究[7]證實，miRNA-150(miR-150)通過靶向SRC激酶信號抑制劑1(SRCIN 1)來調控EPC的血管生成和增殖作用，證明miR-150能促進內皮祖細胞的遷移和血栓的溶解。此外，成熟的內皮細胞可表達止血和纖溶因子。通過流式細胞儀檢測顯示，94%和89%的EPC表達凝血酶受體，包括蛋白酶活化受體-1(PAR-1)和血栓調節(jié)蛋白141(CD 141)，而內皮細胞蛋白C受體(EPCR)表達率為91%；其中，PAR-1是一種蛋白酶激活的G蛋白受體，是凝血酶信號傳遞的主要介質，參與血小板活化、平滑肌細胞遷移和增殖，在血栓形成和溶解過程中起著至關重要的作用。實時定量聚合酶鏈反應(qRT-RCR)法檢測尿激酶型纖溶酶原激活物(u-PA)及其受體(u-PAR)、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑1和2(PAI-1、PAI-2)的表達情況后發(fā)現(xiàn)，上述所有基因在EPC存在時均高水平表達；其中，PAI-1是纖溶系統(tǒng)的關鍵抑制劑，通過抑制t-PA和u-PA而抑制纖維蛋白凝塊的溶解[16-17]。

綜上所述，EPC在血栓形成與溶解過程中扮演著重要的角色，目前的研究已發(fā)現(xiàn)miRNA與EPC之間存在著密切聯(lián)系。因此，進一步探索兩者間關系將為臨床提供更好的診治方案。

1.2 miRNA與血小板 正常情況下，機體的止(凝)血除了依賴于完整的血管壁結構和功能外，有效的血小板質量、數(shù)量，以及正常的血漿凝血因子活性也必不可少。其中，血小板在止血過程中起關鍵作用，可啟動和促進血栓的形成。眾所周知，血小板調節(jié)失衡，以及不適當活化可導致機體凝血與抗凝血系統(tǒng)的失衡，從而導致一系列疾病的發(fā)生，如卒中、心肌梗死、PE等。既往研究認為，血小板僅僅是巨核細胞脫落的簡單碎片;然而，最新的研究發(fā)現(xiàn)，血小板內部還包含了一系列小分子結構，如蛋白質、RNA，以及相應的亞細胞結構等。有研究[18]結果證實，血小板是miRNA、YRNA(一種由血小板衍生的循環(huán)非編碼RNA，全長YRNA具有細胞質或核定位，參與DNA復制的啟動，以及核糖體RNA質量控制)和環(huán)狀RNA的主要來源;在血小板激活的狀態(tài)下，血小板可釋放含有大量蛋白質、炎癥介質和非編碼RNA的微粒體。由于血小板沒有細胞核，無法對miRNA進行轉錄，所以普遍認為其所含物質為從巨核細胞中帶出，故而通過血小板可間接了解骨髓巨核細胞的功能狀態(tài)。

血小板miRNA表達譜在血小板的整個生命周期中均可穩(wěn)定存在，在疾病狀態(tài)時則出現(xiàn)差異表達。在ST段抬高型心機梗死患者中因血小板激活而出現(xiàn)特異性miRNA丟失，某些miRNA的表達較正常人降低70%～90%[19]。其中miRNA-186-5p和miRNA-185-5p下降較明顯,而miRNA-223(miR-223)在非小細胞肺癌(NSCLC)患者血小板中的表達水平較健康者增加10倍以上，在血小板中的表達從健康志愿者的3.86×10-8fmol/L增加到NSCLC患者的1.80×10-6fmol/L[20]。所以，如果血小板在激活時釋放miRNA，那么該miRNA在血漿和血清中表達結果可能相反，即血漿反映血小板未激活狀態(tài)釋放的miRNA，而血清則反應血小板激活后釋放的miRNA[18]。

近期的研究[21]發(fā)現(xiàn),血小板中存在的miRNA-126-3p(miR-126-3p)可調節(jié)血小板的聚集，即在小鼠體內抑制miR-126-3p表達可抑制血小板聚集，而血小板來源的微囊泡(P-MVs)可將miR-223導入到人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)并可通過靶向胰島素樣生長因子1(IGF-1)受體促進HUVEC凋亡，而IGF-1及其受體系統(tǒng)與胰島素抵抗和心血管疾病的發(fā)病機制有關，故miR-223 與心血管疾病之間可能存在著密切的關系[22]。就目前的研究結果來看，血小板與miRNA的關系尚不明確，血小板來源的miRNA是否可作為抗血小板藥物治療的監(jiān)測指標也有待進一步驗證。

1.3 miRNA與凝血因子 組織因子即凝血因子Ⅲ，是凝血級聯(lián)反應的主要引發(fā)者，主要存在于血管內皮細胞，在生理性止血過程中起著至關重要的作用。在正常情況下，機體血液中不含有組織因子，只有當存在炎癥反應或發(fā)生創(chuàng)傷等情況時，血管外組織因子暴露，并與血液中的因子Ⅶ/Ⅶa結合形成組織因子-Ⅶa復合物。組織因子-Ⅶa可激活Ⅹ因子和Ⅸ因子，從而形成凝血酶，最終形成交聯(lián)的纖維蛋白，促進血栓的形成。此外，組織因子在胎盤、大腦、心臟、腎臟和肺等血管豐富的器官中高表達，以避免這些器官在受損時發(fā)生過度出血[23]。

miRNA可穩(wěn)定存在于機體的血液、唾液、尿液等體液中，取樣方便，是目前生物學標志物研究中的熱點。miRNA與組織因子之間的關系也值得探索。一項使用miRNA-145(miR-145)模擬物處理血栓動物模型的研究[24]發(fā)現(xiàn)，通過體內miR-145模擬給藥恢復血栓動物模型體內miR-145水平，可導致組織因子表達水平和活性降低，使血栓形成減少。進一步研究也證實,在靜脈血栓患者體內miR-145表達水平降低，且與患者組織因子水平的升高相關。由此可知，miR-145可能參與了機體組織因子的調節(jié)，靜脈注射miR-145模擬物或許可抑制機體血栓的形成。

此外，研究[25]還發(fā)現(xiàn)存在于內皮細胞的miRNA-19a(miR-19a)可參與血管穩(wěn)態(tài)和動脈粥樣硬化保護機制。miR-19a的高表達與組織因子蛋白的降低、組織因子介導的促凝作用，以及以血管黏附分子-1的表達有關。而進一步對不同級別miR-19a表達情況的檢測也發(fā)現(xiàn)，高miR-19a表達組患者血液中組織因子蛋白水平明顯低于低miR-19a表達組。高miR-19a表達組患者血液中因子Ⅹa活性也明顯低于miR-19a組。最終數(shù)據(jù)顯示,所有患者血漿miR-19a水平與組織因子蛋白和組織因子活性呈顯著負相關。

組織因子的前體為凝血活酶，是外源性凝血途徑的啟動者，其可因多種外源性刺激而在血管平滑肌細胞、內皮細胞和單核細胞中被顯著誘導表達、提高活性。其中，TNF-α可強烈誘導內皮細胞組織因子的表達。Li等[26]在小鼠和培養(yǎng)的內皮細胞實驗中證實，無論有無TNF-α的刺激，miR-223的過表達都可通過結合組織因子 3’-非翻譯區(qū)(3’UTR)的序列來抑制組織因子的促凝活性,表明miR-223不僅能抑制組織因子的促凝活性，而且能部分阻斷TNF-α誘導的內皮細胞中組織因子促凝活性的增加。故miRNA可為抑制患者血栓形成提供一種可能的治療方法。

2 miRNA對VTE的診斷價值

目前，相關研究主要通過微陣列分析或miRNA基因芯片高通量檢測進行篩選miRNA，然后再對所檢測的血漿或血清中可疑的miRNA進行定量RT-RCR予進一步驗證。自確認miRNA穩(wěn)定存在于血漿、血清等體液以來，其已被陸續(xù)證明在包括VTE在內的多種疾病中具有潛在診斷價值。

2.1 miRNA對DVT的診斷價值 DVT多發(fā)生于下肢。血漿D-二聚體是目前唯一在臨床上得到廣泛應用的生物學標志物，主要反映纖維蛋白降解水平，陰性結果是排除DVT的有力證據(jù)，但陽性結果特異度低，在多種非血栓性疾病中也可升高，包括彌散性血管內凝血、感染、腫瘤等。

目前的研究已發(fā)現(xiàn)miRNA在DVT中有潛在診斷價值。一項關于骨科手術后DVT患者(18例患者和20名健康對照者)的研究[24]發(fā)現(xiàn)，DVT患者血清miRNA-582、miRNA-532和miRNA-195的水平較對照組顯著升高(AUC=0.959、1.000、1.000)。進一步的研究[27]結果也證實血漿miRNA-320b水平升高與D-二聚體水平相關(AUC=0.79)，提示血漿miRNA-320b和D-二聚體聯(lián)合檢測可提高DVT診斷準確率。在對比12例DVT患者與12例無DVT患者血漿miRNA差異表達譜后發(fā)現(xiàn)，13種miRNA在兩組間存在差異表達，DVT組血漿miRNA-143-3p與miRNA-424-5p表達較對照組高1.5倍，而miRNA-136-5p水平則顯著低于無DVT者;經過性別、年齡、BMI和吸煙比例校正后，兩組間miRNA-136-5p[OR(95%CI)=0.65(0.45～0.94)，P=0.02]和miRNA-424-5p[OR(95%CI)，1.89(1.24～2.87)，P=0.003]的差異仍存在統(tǒng)計學意義[28]。此外，miRNA-195也被發(fā)現(xiàn)在DVT患者血清中具有較高的表達水平，可通過靶向作用于γ-氨基丁酸(GABA)A型受體相關蛋白1(GABARAPL 1)調節(jié)人體EPC增殖、遷移和自噬等。可能是DVT患者潛在的生物學標志物[15]。

綜上，目前多項研究結果表明，某些miRNA與DVT和機體高凝狀態(tài)有關，盡管已知miRNA似乎不能很好地作為潛在的診斷標志物，但這將指導研究者對其進行更深一步探索，為進一步減少侵入性檢查提供依據(jù)。

2.2 miRNA對PE的診斷價值 PE是一種危及生命的疾病。研究[24]結果表明，血流動力學穩(wěn)定的PE患者3個月病死率為6%～11%，血流動力學不穩(wěn)定或休克的PE患者病死率則為30%或更高。目前，臨床診斷PE的方法包括生物學標志物(如D-二聚體)、靜脈加壓超聲和放射性核素顯像、肺通氣灌注顯像，以及作為金標準的CT肺動脈造影(CTPA)，診斷靈敏度可達90%。然而對于那些無法進行CTPA、腎衰竭或對造影劑過敏的患者，仍然需要簡單可靠的生物學標志物檢測。近期的研究[29]結果顯示，仍有超過三分之一的PE病例在急診科被漏診。

一項基于32例急性肺栓塞(APE)患者、32名健康對照者和22例非APE患者(臨床以呼吸困難、胸痛或咳嗽為主要表現(xiàn))的研究[29]發(fā)現(xiàn)，APE組血漿miRNA-134(miR-134)水平高于正常對照組和非APE組，即血漿miR-134是APE的特異性診斷指標，區(qū)分APE組與健康對照組或非APE組的AUC分別為0.833和0.756。 Zhou等[30]對37例PE患者和正常對照者進行了miRNA檢測后發(fā)現(xiàn)，PE患者血漿中的miRNA-28-3p(miR-28-3p)升高至健康對照者的393倍，進一步行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析表明，miR-28-3p可能參與PE相關通路，如磷酸肌醇代謝和磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)。因此，血漿miR-134、miR-28-3p或可作為一種無創(chuàng)、穩(wěn)定的PE檢測生物學標志物。Liu 等[31]在比較60例APE患者與50例健康對照者血漿miRNA后發(fā)現(xiàn)，APE患者的miRNA-221(miR-221)表達明顯增高(AUC=0.823,95%CI為0.757～0.906)，與D-二聚體聯(lián)合檢測時AUC=0.768，95%CI為0.727～0.853,提示miR-221可能是APE的生物學標志物。

此外，一項基于對30例經CT血管造影診斷為APE的患者與12例健康對照者的研究[32]證實，miRNA-1233(miR-1233)分別鑒別APE與非ST段抬高型心機梗死患者和健康人的靈敏度均為90%，特異度分別為100%和92%，AUC分別為0.95和0.91，該研究也證實APE患者血清中miR-134和miRNA-27a(miR-27a)表達水平升高,與健康對照者的AUC分別為0.84和0.79。然而，與健康對照者相比，無論是miR-1233與miR-134(AUC=0.88)或者miR-27a與miR-1233(AUC=0.89)兩兩組合,還是miR-1233、miR-134和miR-27a(AUC=0.90)三者聯(lián)合檢測,其診斷價值均低于單獨檢測miR-1233(AUC=0.91)。由此可知，miR-1233是一種很有前景的APE診斷生物學標志物。而通過對78例經CTPA確診的APE患者和70例年齡和性別匹配的正常志愿者研究比較的結果提示，將miR-27a或miR-27b與D-二聚體聯(lián)合應用可能是診斷APE強有力的生物學標志物[33]。

3 結語與展望

近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在細胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡等過程中起著至關重要的作用。由于其在機體中的高度穩(wěn)定性，使得循環(huán)miRNA在包括藥物性肝損傷、腫瘤、心力衰竭、2型糖尿病、穩(wěn)定型心絞痛和ACS等疾病中作為生物學標志物得以廣泛研究。理想的生物學標志物檢測時應可重復性高，并且對某一特定疾病具有較高的靈敏度和特異度。miRNA在血漿或血清中穩(wěn)定性較高，結構簡單，無需后期處理修飾，有望成為理想的生物學標志物。目前，關于miRNA與VTE的研究仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。首先，循環(huán)miRNA的檢測數(shù)據(jù)十分有限，研究的樣本量均較小，需要對包含更大的樣本量,以及不同病程的VTE患者行進一步分析以探索其有效性和普遍性；其次，樣本選擇偏倚，不同樣本或存在不同的表達水平；再者，循環(huán)miRNA的分析與檢測方法缺乏標準化，不同檢測方法或有不同實驗結果；最后，各種miRNA參與機體的調節(jié)機制仍不明確，需要更深入的研究來探索其致病機制，以期更好地為VTE的診斷和預后提供新方法。