環(huán)狀RNA在腎透明細(xì)胞癌中作用的研究進(jìn)展

程 長 楊 宸 姜昊文

1 環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)的概況

據(jù)估計，人類基因組中有超過70%的DNA可被轉(zhuǎn)錄為RNA，但其中僅約2%被最終翻譯為蛋白質(zhì)，剩余絕大多數(shù)是包含核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA等在內(nèi)的非編碼RNA(ncRNA)。根據(jù)所含核苷酸的多寡，通常以200個核苷酸長度為界，將ncRNA分為長鏈ncRNA(lncRNA)和短鏈ncRNA，后者又稱非編碼小RNA(snmRNA)。snmRNA是一類對基因表達(dá)具有調(diào)控功能的RNA分子，如核內(nèi)小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、小干擾RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)等[1]。

無論長度、功能如何迥異，上述RNA均為傳統(tǒng)認(rèn)知上的線性RNA分子。與之不同的circRNA則是一類擁有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈ncRNA[2]，于20世紀(jì)70年代在植物、病毒、真核細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)[3-4]。之后較長時期里，circRNA始終被認(rèn)為是因RNA的異常剪接而形成的無功能副產(chǎn)物[5]。近年來,由于高通量RNA測序和生物信息學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了circRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)廣泛，可能是基因表達(dá)的一種普遍形式[6]。人類龐大的基因組中亦檢測出數(shù)千種可作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)器的circRNA，在惡性腫瘤(如肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等)和其他多種疾病中，circRNA作為miRNA海綿調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程[7]。由此，circRNA逐漸被認(rèn)為除了具有高豐度、高度穩(wěn)定性、高度保守性的“三高”特性外，尚有組織分化階段的特異性，可參與基因表達(dá)調(diào)控等細(xì)胞活動，是疾病潛在的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點[6,8-9]。

2 circRNA的合成與結(jié)構(gòu)

circRNA大多由2或3個外顯子組成，稱為外顯子circRNA(ecircRNA)。在已確認(rèn)的circRNA家族中，ecircRNA占80%以上[10]。但有時外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子得以保留，從而構(gòu)成外顯子-內(nèi)含子circRNA(EIciRNA)。此外，還存在單純由內(nèi)含子構(gòu)成的內(nèi)含子circRNA(ciRNA)[11]。ecircRNA主要位于細(xì)胞質(zhì)中，EIciRNA和ciRNA通常位于細(xì)胞核內(nèi)[10-12]。

circRNA絕大部分源自對mRNA前體外顯子的反向剪接，借3’,5’-磷酸二酯鍵連接而成[13]，且該過程對位于剪接位點附近的外顯子序列似乎無特定要求[14]。Jeck等[10]曾提出兩種circRNA形成的模型——內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化模型和套索驅(qū)動的環(huán)化模型。全基因組分析結(jié)果表明，參與構(gòu)成circRNA的外顯子上、下游通常存在反向互補(bǔ)配對的內(nèi)含子序列。這些序列通過堿基互補(bǔ)配對使外顯子的下游5’端受體和上游3’端供體相互靠近，最終憑借反向剪接形成circRNA，即內(nèi)含子配對驅(qū)動下的環(huán)化模型。套索模型是mRNA前體由于出現(xiàn)部分折疊形成套索狀結(jié)構(gòu)而發(fā)生外顯子跳讀，被跨越的、位于中間區(qū)域的外顯子通過剪接、環(huán)化而形成circRNA[15]。

因此，由上述circRNA的形成過程可知，其不具備尋常線性RNA所共有的5’端帽狀結(jié)構(gòu)和3’端多聚腺苷酸尾。封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)又使其免受核糖核酸外切酶(RNase R)的酶切作用，令其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在[10]。近年來，多項研究[16-17]通過RNase R降解線性RNA分子，特異性地保留、富集circRNA后進(jìn)行測序，以分析在不同生理、病理狀態(tài)下生物細(xì)胞中特定或某些circRNA的數(shù)量變化。

RNA結(jié)合蛋白(RBP)可對circRNA的合成進(jìn)行調(diào)節(jié)[10,13,18]。在剪接因子Muscleblind1(Mb1)蛋白自身的mRNA前體外顯子兩側(cè)，存在能夠與Mb1蛋白相結(jié)合的內(nèi)含子序列，Mb1蛋白與該位點結(jié)合后可促進(jìn)circRNA的合成[13]。另一種剪接因子Quaking Ⅰ(QK Ⅰ)在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)上調(diào)，QKⅠ結(jié)合至外顯子上、下游的內(nèi)含子序列之后再進(jìn)一步二聚化，使位于其中的外顯子逐漸靠近、環(huán)化，最終亦促進(jìn)circRNA合成[18]。RNA依賴性腺苷脫氨酶1的作用恰恰相反，其發(fā)揮RNA編輯作用破壞外顯子兩側(cè)序列間的配對關(guān)系，抑制后續(xù)的反向剪接過程[9,19]。RBP的種類成百上千，尚有許多參與調(diào)控circRNA合成的RBP未被揭示。除此之外，RBP之間的相互作用對circRNA合成甚至其功能發(fā)揮的影響也是目前研究的一大趨勢。

3 circRNA的功能

除決定特性外，circRNA特殊的結(jié)構(gòu)與合成方式還賦予其許多重要的生物學(xué)功能，雖然絕大多數(shù)功能尚不完全明確，但最常見的是作為miRNA的“海綿”，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[10,20]。以下簡要闡述其已被發(fā)現(xiàn)的主要功能。

3.1 circRNA作為miRNA海綿在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié)基因表達(dá) 研究[20]結(jié)果證實，不少circRNA富含miRNA結(jié)合位點，在細(xì)胞中扮演miRNA海綿的角色。circRNA憑借這些保守位點與miRNA競爭性結(jié)合，抑制miRNA對其靶基因的沉默作用，上調(diào)靶基因的表達(dá)，這一作用機(jī)制被稱為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)機(jī)制，這些miRNA結(jié)合位點被稱為miRNA應(yīng)答元件(MRE)[21]。除了circRNA，lncRNA、假基因等也具有少量MRE，可作為ceRNA來發(fā)揮miRNA海綿的作用，不過作用較circRNA弱。circRNA含量的增減可在一定程度上影響miRNA對靶基因表達(dá)的調(diào)控作用，這也是circRNA在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的主要功能[7]。最具代表性的circRNA是人類小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物(CDRlas，又名ciRS-7)，擁有約74個相對保守的miRNA-7結(jié)合位點。越來越多的證據(jù)表明，miRNA-7涉及多條調(diào)控腫瘤發(fā)生相關(guān)的通路，如miRNA-7直接下調(diào)促癌因子表皮生長因子受體的表達(dá)[22]；Ning等[23]發(fā)現(xiàn)，miRNA-7通過減少p65表達(dá)來活化NF-κB通路以抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。然而，ciRS-7(circular RNA sponge for miRNA-7)作為miRNA-7的海綿，可抑制后者的功能，上調(diào)其原癌靶基因的表達(dá)，下調(diào)抑癌靶基因，從而在一系列惡性腫瘤(如肝細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌和宮頸癌等[24-27])的發(fā)生、發(fā)展中，發(fā)揮不同程度的促癌作用。此外，研究[28]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circBCRC-3通過結(jié)合miRNA-182-5p來抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，說明circRNA依據(jù)其“吸納”的miRNA不同而在不同腫瘤，甚至同一腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用。

3.2 細(xì)胞核內(nèi)的circRNA在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá) 研究[29]結(jié)果顯示，一些EIciRNA如circEIF3J、circPAIP2能夠在細(xì)胞核內(nèi)與U1核小核糖核蛋白顆粒(snRNP)相互作用，構(gòu)成EIciRNA-U1 snRNP復(fù)合體后與RNA聚合酶Ⅱ在其親本基因的啟動子處結(jié)合，上調(diào)該基因的表達(dá)。位于細(xì)胞核中的ciRNA也有相似的功能，如ci-ankrd52可增強(qiáng)RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄，敲除ci-ankrd52致使其親本基因表達(dá)下調(diào)[11]。

通過對人類circRNA的分析發(fā)現(xiàn)，其擁有相當(dāng)高密度的RBP結(jié)合位點，可作為RBP海綿[30]。RBP在RNA的可變剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯等轉(zhuǎn)錄后過程中起調(diào)控作用，參與到包括細(xì)胞增殖、分化、遷移、衰老、凋亡和氧化應(yīng)激等在內(nèi)的多種生物學(xué)活動[31]。研究[11,13,18,20]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circRNA可穩(wěn)定地與Argonaute(AGO)蛋白、QKⅠ、Mb1、RNA聚合酶Ⅱ、真核起始因子4A-Ⅲ等RBP結(jié)合構(gòu)成RNA-蛋白復(fù)合體，進(jìn)而同相應(yīng)的線性RNA發(fā)生相互作用[6]。譬如，circPABPN1可與PABPN1基因的mRNA競爭RBP HuR蛋白，致使下游PABPN1的翻譯受到影響[32]。

3.3 circRNA可翻譯多肽或蛋白質(zhì) 雖然不少研究認(rèn)為circRNA不能通過結(jié)合核糖體以翻譯蛋白質(zhì)，但近來也發(fā)現(xiàn)少數(shù)具備內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點或原核核糖體結(jié)合位點的circRNA可以編碼蛋白質(zhì)[33-34]。Yang等[35]首次報道了在人類細(xì)胞中N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)修飾能夠有效促進(jìn)circRNA的翻譯進(jìn)程。m6A驅(qū)動的翻譯過程廣泛存在，因此擁有編碼蛋白質(zhì)潛能的circRNA不在少數(shù)，且單一的m6A位點即可驅(qū)動翻譯發(fā)生。這一過程可被甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14強(qiáng)化，被去甲基化酶[如肥胖相關(guān)基因(FTO)編碼的蛋白]抑制。雖然由circRNA翻譯的蛋白質(zhì)功能未被全然揭示，但在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下circRNA的翻譯水平會產(chǎn)生變化。如饑餓狀態(tài)將致使細(xì)胞內(nèi)的circMb1翻譯能力提升[36]，m6A驅(qū)動的翻譯過程可被熱休克反應(yīng)上調(diào)[35]。

近年來，circRNA的其他功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)，如可逆轉(zhuǎn)錄形成假基因[37]、大量存在于外泌體中以增強(qiáng)細(xì)胞間相互作用等[38]。

4 腎透明細(xì)胞癌(clear cell RCC, ccRCC)的概況

腎細(xì)胞癌(簡稱腎癌) 作為最常見的腎占位性病變，起源于腎小管上皮細(xì)胞，好發(fā)于60～70歲人群。其同時也是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在成年人惡性腫瘤中約占3%，在男、女性癌癥發(fā)病率中分別位居第11和第5位[39]。ccRCC是腎癌最常見的病理類型，占比高達(dá)80%～90%，其他病理類型包括乳頭狀腎細(xì)胞癌、腎嫌色細(xì)胞癌等[39]。ccRCC放射治療、化學(xué)治療的療效均欠佳，手術(shù)治療是目前最佳的治療方式，但接受根治性手術(shù)者也存在較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險[40]。ccRCC的總生存率約為74%，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后不佳，早期發(fā)現(xiàn)對患者預(yù)后具有重要意義。近年來，多項研究圍繞ccRCC的診治展開，包括探索新的療法、建立MDT、尋找診斷或判斷預(yù)后的相關(guān)腫瘤標(biāo)志物等[39]。circRNA的生物學(xué)功能使其在多種疾病，尤其是惡性腫瘤中愈加受到關(guān)注，其可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)間相互作用等影響腫瘤細(xì)胞的生物活動，有可能成為新型腫瘤標(biāo)志物或治療靶點。

5 circRNA在ccRCC中的研究

Huang等[41]發(fā)現(xiàn)，circABCB10在5種ccRCC細(xì)胞系(A498、Cal-54、ACHN、Caki-2和Hs891.T)中的表達(dá)顯著高于正常腎小管上皮細(xì)胞，以在A498中最為顯著；circABCB10的過表達(dá)將促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)促凋亡蛋白cleaved-Caspase3的表達(dá)，說明circABCB10尚有抑制細(xì)胞凋亡的作用，并在120例ccRCC患者的癌組織與癌旁正常組織中得以驗證，發(fā)現(xiàn)circABCB10的表達(dá)量與病理分級、TNM分期呈正相關(guān)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，circABCB10高表達(dá)是ccRCC不良預(yù)后的獨立危險因素。

Zhou等[42]發(fā)現(xiàn)了一個新的circRNA——circPCNXL2，其在ccRCC中表達(dá)顯著上調(diào)，之后進(jìn)一步證實circPCNXL2可發(fā)揮海綿作用結(jié)合miRNA-153，導(dǎo)致后者的靶基因E盒結(jié)合鋅指蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)ccRCC的增殖與侵襲能力。Xiong等[43]也發(fā)現(xiàn)，circ-ZNF609結(jié)合miRNA-138-5p上調(diào)叉頭框轉(zhuǎn)錄蛋白4基因(FOXP4)表達(dá)，作為促癌因子促進(jìn)ccRCC的進(jìn)展。

Han等[44]通過癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)雌激素受體β(ERβ)的表達(dá)量可影響ccRCC的進(jìn)展和生存率。之后又進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ERβ通過直接結(jié)合細(xì)胞膜鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶1(ATP2B1)基因的啟動子抑制circATP2B1的表達(dá)，繼而抑制miRNA-204-3p導(dǎo)致其靶基因纖維粘連蛋白1(FN1)的表達(dá)上調(diào)，最終促進(jìn)ccRCC的轉(zhuǎn)移。

然而，Wang等[45]在52例接受根治性手術(shù)的ccRCC患者中發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001451在癌組織中的表達(dá)顯著低于正常癌旁組織。后續(xù)體外實驗結(jié)果表明，敲除該circRNA可促進(jìn)ccRCC細(xì)胞系的增殖，抑制其凋亡。雖然該實驗僅對has_circ_0001451可結(jié)合的miRNA及其下游靶基因進(jìn)行了預(yù)測，但也證實不同circRNA在ccRCC乃至惡性腫瘤中可能發(fā)揮促癌或抑癌這兩種截然相反的作用。

上述研究皆基于circRNA作為miRNA海綿的內(nèi)源競爭(ceRNA)原理。然而circRNA可能也于細(xì)胞內(nèi)扮演“miRNA儲備庫”的角色，穩(wěn)定miRNA的表達(dá)，起到與ceRNA相反的作用。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，ccRCC患者中男性患者的生存率普遍低于女性[46]。其中雄激素受體(AR)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，在促進(jìn)ccRCC轉(zhuǎn)移中起重要作用，但其機(jī)制尚不明確。Wang等[47]發(fā)現(xiàn)的circHIAT1(即hsa_circ_001013)在ccRCC中的表達(dá)低于毗鄰正常組織，且其在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)量低于非轉(zhuǎn)移者。與circRNA通常扮演的miRNA海綿角色不同，circHIAT1可作為“miRNA儲備庫”穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)miRNA-195-5p、miRNA-29a-3p、miRNA-29c-3p的同時，不抑制miRNA的基因沉默作用。后者通過結(jié)合細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cdc42)基因3’非編碼區(qū)導(dǎo)致CDC42蛋白表達(dá)下降，從而抑制ccRCC的轉(zhuǎn)移與侵襲。但由于AR結(jié)合HIAT1基因啟動子區(qū)域的雄激素反應(yīng)元件(ARE)調(diào)控其表達(dá)，導(dǎo)致circHIAT1表達(dá)下調(diào)，最終引起CDC42含量增加，促進(jìn)ccRCC的轉(zhuǎn)移。因此，由上述信號通路可看出，針對AR或circHIAT1這兩個新靶標(biāo)的治療方法可能為控制ccRCC轉(zhuǎn)移，改善其預(yù)后提供新的思路。目前關(guān)于circRNA在ccRCC中作用的研究見表1。

表1 目前關(guān)于ccRCC的circRNA研究

6 結(jié) 語

目前,對于cirRNA在ccRCC中作用的探究多以“circRNA-miRNA-靶基因軸”為基礎(chǔ)，circRNA的其他生物學(xué)功能，例如翻譯多肽、提供“平臺”調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)間相互作用等在ccRCC中鮮有報道。相信隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，對circRNA探索的不斷深入，circRNA將會更多地應(yīng)用于ccRCC的診斷、治療、復(fù)發(fā)監(jiān)測等疾病管理方面。