淫羊藿苷對血管緊張素Ⅱ誘導腎纖維化的保護作用研究

顧向晨 張紅利 程 燁 王 怡 陳 敏

研究[1-2]結果表明，RAAS的激活和腎臟局部血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)產(chǎn)生的增多在腎臟纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用，尤其是在糖尿病腎病相關的腎臟纖維化中扮演關鍵角色。據(jù)報道[3-5]，雌激素可以緩解多種動物模型(包括糖尿病腎病動物模型)誘導的腎間質纖維化，但是該激素較多不良反應限制了其在臨床的應用和普及。雌激素樣作用藥物可代償性升高機體雌激素水平，并可安全、有效地拮抗RAAS激活誘導的腎臟纖維化[6-7]。中藥仙靈脾的有效成分淫羊藿苷(icariin)可發(fā)揮雌激素樣作用，具有抗腎臟纖維化的優(yōu)勢[8-9]?；谏鲜鑫墨I報道，本研究嘗試探索淫羊藿苷在Ang Ⅱ誘導的腎纖維化中的保護作用，及其可能的作用機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物和材料 本研究通過上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核批準(動物倫理批準號為15559)。選用36只清潔級雌性Wistar大鼠，12周齡，體重為200～300 g；均購自上海市斯萊克實驗動物有限公司，合格證號為2013001807198。逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒均購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,Tgfβ1)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，Ctgf)、纖維粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、Ⅰ型膠原 (collagen type Ⅰ，ColⅠ)α1、Ⅲ型膠原 (collagen type Ⅲ，ColⅢ)α1、Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，ColⅣ)α1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Gapdh)、β-肌動蛋白(β-actin)基因引物序列均由上海達維科生物科技有限公司合成。

1.2 實驗動物分組 將36只雌性Wistar大鼠隨機分為6組，即假手術(Sham)組、假手術+血管緊張素Ⅱ(Sham+AngⅡ)組、假手術+血管緊張素Ⅱ+淫羊藿苷(Sham+AngⅡ+I)組、手術去勢(OVX)組、手術去勢+血管緊張素Ⅱ(OVX+AngⅡ)組、手術去勢+血管緊張素Ⅱ+淫羊藿苷(OVX+AngⅡ+I)組，每組6只。

1.3 動物模型和細胞模型建立

1.3.1 大鼠OVX模型建立 以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉各組大鼠后，切開Sham組、Sham+AngⅡ組、Sham+AngⅡ+I組大鼠背部后不予任何處理，縫合手術切口。切開OVX組、OVX+AngⅡ組、OVX+AngⅡ+I組大鼠背部后，在腎臟下方脂肪內取出卵巢，用止血鉗結扎雙側輸卵管，切除雙側卵巢，手術完成后消毒，逐層縫合手術切口。

1.3.2 大鼠AngⅡ模型建立 以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉各組大鼠后，均于大鼠背部植入購自美國加州Alzet公司的藥物泵(型號為2ML4 Osmoticminipump)，以2.5 μL/h速度持續(xù)釋放藥物溶液28 d。Sham組和OVX組植入的藥物泵僅含有0.9%氯化鈉溶液，其余4組大鼠植入的藥物泵均為含有AngⅡ的0.9%氯化鈉溶液并給予1 000 ng/(kg·min)的AngⅡ泵注。

1.3.3 藥物干預模型建立 在建立大鼠AngⅡ模型的同時，將淫羊藿苷粉劑溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，稀釋成質量濃度為20 g/L的淫羊藿苷混懸液，并分別對Sham+AngⅡ+I組和OVX+AngⅡ+I組大鼠進行灌胃，100 mg/(kg·d),1次/d，持續(xù)28 d。造模完成后，以10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉各組大鼠，心臟取血后處死大鼠，再以0.9%氯化鈉灌注獲取組織。

1.3.4 細胞培養(yǎng)和處理 取處于對數(shù)生長期的大鼠腎臟正常成纖維細胞株(NRK-49F，來源于美國ATCC細胞庫)，以含5%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液混懸細胞后，將細胞種植于10 cm細胞培養(yǎng)皿，待細胞生長至60%～70%融合度后，以含0.5%小牛血清培養(yǎng)液饑餓細胞48 h以完成同步化，并分為3組，即對照組[僅添加二甲基亞砜(DMSO)溶液]、AngⅡ組、AngⅡ+I組。予DMSO處理對照組。予10-6mol/L AngⅡ 刺激AngⅡ組細胞。AngⅡ+I組在加入10-6mol/L AngⅡ前1 h，予10-6mol/L 溶于DMSO的淫羊藿苷預處理。24 h后收集各組細胞株，以備提取細胞總RNA。

1.4 檢測項目與方法

1.4.1 腎功能和尿微量白蛋白/肌酐(MA/Cr)檢測 應用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清尿素氮和血清肌酐值，采用免疫比濁法檢測各組大鼠尿MA/Cr比值。

1.4.2 雌二醇(E2)和促卵泡素(FSH)檢測 采用ELISA法測定各組實驗大鼠血清E2和FSH水平。

1.4.3 腎臟組織間質纖維化程度測定 石蠟包埋各組大鼠腎臟組織，行Masson染色。在每張組織切片中，隨機挑選10個200倍視野進行拍照、觀察。應用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每張照片的視野，計算藍色膠原纖維面積與所拍攝組織面積的比值，定量各樣本膠原纖維面積百分比。

1.4.4 實時熒光定量PCR法檢測目的基因表達 ①總RNA提?。翰捎妹绹鳬nvitrogen 生命技術有限公司的TRIzol裂解液裂解各組腎臟組織或細胞，提取組織或細胞總mRNA。②逆轉錄：按照美國Applied Bioscience公司的逆轉錄試劑盒操作步驟，將提取的mRNA逆轉錄為cDNA。③實時定量PCR法：以cDNA為模板行目的基因擴增。檢測各基因在各實驗組樣本中的表達水平，擴增后目的基因相對表達量=2-(目的基因CT-內參基因CT)。體內、體外各組纖維相關基因以倍數(shù)值表達，即各處理組與對照組的比值。

2 結 果

2.1 各組大鼠腎功能和尿MA/Cr值比較 與Sham組相比，OVX組血清肌酐、尿素氮水平和尿MA/Cr值均輕度升高，但差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。Sham+AngⅡ組和OVX+AngⅡ組血清肌酐、尿素氮和尿MA/Cr值分別較Sham組和OVX組顯著升高(P值均<0.05)。 Sham+AngⅡ+I組和OVX+AngⅡ+I組血清肌酐、尿素氮水平和尿MA/Cr值分別較Sham+AngⅡ組與OVX+AngⅡ組顯著降低(P值均<0.05)。上述結果證實，淫羊藿苷干預可緩解AngⅡ引起的大鼠腎功能損傷。見表1。

表1 各組模型大鼠腎功能指標和尿MA/Cr值比較

2.2 各組大鼠E2和FSH水平比較 與Sham組比較，Sham+AngⅡ組和Sham+AngⅡ+I組E2和FSH水平的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)；而OVX組和OVX+Ang Ⅱ 組E2水平均顯著降低(P值均<0.05)。與OVX+Ang Ⅱ組比較，OVX+Ang Ⅱ+I組E2水平顯著升高(P值均<0.05)。行去勢手術的3組FSH水平均分別較未行去勢手術的3組顯著升高(P值均<0.05)。通過檢測各組E2和FSH表達水平，證實去勢手術可刺激各模型動物FSH水平升高、E2水平降低，而淫羊藿苷干預可逆轉去勢手術后E2的表達水平。見表2。

表2 各組模型大鼠E2和FSH水平比較

2.3 各組大鼠腎臟組織間質纖維化程度比較 與Sham組[(1.53±0.71)%]比較，Sham+AngⅡ 組腎間質纖維化面積[(7.56±2.31)%]顯著增大(P<0.05)，Sham+AngⅡ+I組腎間質纖維化面積[(1.83±1.48)%]顯著縮小(P<0.05)。與OVX組[(1.61±1.58)%]比較，OVX+Ang Ⅱ組腎間質纖維化面積[(9.30±4.61)%]亦顯著增大(P<0.05)，而OVX+AngⅡ+I組腎間質纖維化面積[(1.86±1.62)%]顯著縮小(P<0.05)。結果證實，淫羊藿苷可顯著減輕Ang Ⅱ誘導的腎臟纖維化程度。見圖1。

A Sham組 B Sham+AngⅡ組 C Sham+AngⅡ+I組 D OVX組 E OVX+AngⅡ組 F OVX+AngⅡ+I組；標尺距離為20 μm圖1 各組大鼠腎臟間質纖維化程度(Masson染色，×200)

2.4 各組大鼠腎臟組織纖維化相關基因mRNA表達比較 為進一步檢測纖維化相關mRNA水平有無變化，本研究檢測了Tgfβ1、Ctgf、Fn、ColⅠα1、ColⅢα1、ColⅣα1 mRNA的表達水平。OVX組與Sham組纖維化基因表達水平的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)。與Sham組比較，Sham+Ang Ⅱ組纖維化相關基因表達量均顯著增加(P值均<0.05)； Sham+Ang Ⅱ+I組纖維化相關基因表達量均較Sham+Ang Ⅱ組顯著下降(P值均<0.05)。與OVX組比較， OVX+Ang Ⅱ組纖維化相關基因表達量均顯著增加(P值均<0.05)；與OVX+Ang Ⅱ組比較，OVX+Ang Ⅱ+I組纖維化相關基因表達量均顯著下降(P值均<0.05)。結果證實，淫羊藿苷通過干預纖維化相關基因表達介導腎臟保護作用。見表3。

表3 各組模型大鼠纖維化因子mRNA表達水平

2.5 各組NRK-49F細胞株Fn和ColⅠα1 mRNA表達水平比較 為進一步明確淫羊藿苷是否直接作用于腎臟成纖維細胞，抑制該細胞表達纖維化因子，予AngⅡ刺激和淫羊藿苷干預NRK-49F細胞株。與對照組相比較，AngⅡ組Fn和ColⅠα1 mRNA水平均顯著升高(P<0.01)。與AngⅡ組相比，AngⅡ+I組Fn和ColⅠα1 mRNA水平顯著降低(P<0.01)。結果提示，淫羊藿苷可下調AngⅡ誘導的細胞纖維化因子表達。見表4。

表4 淫羊藿苷處理對纖維化因子mRNA表達變化影響

3 討 論

沈自尹[10]研究認為，“腎為先天之本，是元陰元陽之所，五臟之陰非此不能滋，五臟之陽非此不能發(fā)”。在人生長、發(fā)育、壯盛和衰老的生命過程中，腎臟的功能正常與否對機體的生命質量起著舉足輕重的影響。應用補腎中藥，可使患者腎氣得復、氣化通利、水道通暢，病情趨于痊愈?，F(xiàn)代藥理學對補腎藥物進行的單味中藥藥理研究[11]發(fā)現(xiàn), 鹿茸、補骨脂、蛇床子、紫河車、鎖陽、仙茅、仙靈脾、菟絲子、肉從蓉、巴戟天、杜仲都具有性激素樣作用, 能促進雌性動物子宮、卵巢發(fā)育，尤以仙靈脾研究較多。據(jù)報道[12]，仙靈脾可上調小鼠子宮增重的幅度和小鼠體內雌激素水平；因其主要有效成分為具有植物雌激素樣作用的淫羊藿苷。

本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷在AngⅡ誘導的腎纖維化模型中具有確切的保護作用，Masson染色檢測和纖維化因子mRNA水平表達檢測，以及腎功能指標檢測結果均提示，淫羊藿苷干預可抑制動物模型組織纖維化相關基因表達水平、縮小腎臟組織纖維化面積。本研究中，與Sham+AngⅡ組相比，OVX+AngⅡ組大鼠血清尿素氮水平和纖維化相關基因mRNA表達水平均顯著升高，此結果與臨床上觀察到的男性較女性更易發(fā)生慢性腎臟病，且男性患者疾病進展較快的現(xiàn)象相一致；圍絕經(jīng)期女性患者慢性腎臟疾病病情進展顯著快于未絕經(jīng)女性患者[13-14]。已有研究[1-2,15]結果證實，雌激素水平的升高可抑制多種動物疾病模型導致的腎臟組織腎纖維化的進展；外源性雌激素替代治療可減輕疾病模型大鼠的腎間質纖維化。本研究中，與OVX+AngⅡ組大鼠相比，予淫羊藿苷干預后，大鼠E2水平顯著升高；而在未去勢組中，予淫羊藿苷干預后，大鼠E2水平亦有上升趨勢；證實淫羊藿苷作為一種植物來源的雌激素樣物質，可能具有緩解AngⅡ誘導的腎臟纖維化作用。

雌激素作用的發(fā)揮主要依賴于其與受體α和β的相結合。本課題組曾嘗試驗證淫羊藿苷是否有類雌激素樣作用，以及是否通過與雌激素受體結合，影響下游纖維化因子的表達;結果發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激或淫羊藿苷干預后雌激素受體α和β在蛋白和mRNA水平的表達均無顯著變化(實驗數(shù)據(jù)未顯示)。在上述研究中，同組樣本間雌激素受體α和β的mRNA表達水平具有較大差異，致使數(shù)據(jù)缺乏統(tǒng)計學意義；同時，上述研究樣本量較小，需設計大樣本量、細化分組的動物實驗進一步驗證相關結論。有研究[16]結果顯示，在雌激素受體α和β敲除小鼠的心臟驟停引發(fā)急性腎損傷的模型中，外源性雌激素的干預仍可顯示出腎臟保護作用，提示雌激素可能通過其他途徑發(fā)揮該作用。雌激素可通過與G蛋白偶聯(lián)的雌激素受體1(G-protein coupled estrogen receptor 1， GPER1)結合，反式激活表皮生長因子受體，并進一步激活下游磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶 B(PI3K/Akt)信號通路，調整下游基因表達水平[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，在乳腺腫瘤細胞株中，17-β E2可通過GPER1，激活細胞外調節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路，抑制轉化生長因子β/果蠅去功能化蛋白(TGF-β/Smad)信號通路作用。此外，GPER1激動劑可激活GPER1，從而抑制心臟成纖維細胞的增殖[19]。GPER1在腎小管上皮細胞亦有表達，雌激素可激活GPER1，增加近曲小管巨蛋白(megalin)表達，減少氧自由基的生成[20]。亦有研究[21]結果顯示，激活GPER1可以抑制系膜細胞合成細胞外基質和系膜細胞的遷移 。因此，GPER1的激活，可參與調控自噬、增殖、炎癥反應等一系列信號通路，并抑制組織和細胞纖維化的發(fā)生和發(fā)展[19,22-24]。

研究[25]結果顯示，淫羊藿苷可緩解硫代乙酰胺導致的肝臟纖維化。淫羊藿苷對早期糖尿病性腎病和順鉑導致的急性腎損傷動物模型，也有明確的保護作用[26-27]。另外，淫羊藿苷預處理的人臍帶間充質干細胞輸注至慢性腎衰竭或慢性肝損傷的大鼠體內，可顯著減輕模型大鼠臟器纖維化程度[28-29]。同時，淫羊藿苷對 IgA 腎病模型大鼠纖維化的腎小球具有保護作用[30]。體外實驗[31]結果證實，淫羊藿苷可以通過激活 GPER1、 下調 TGF-β信號通路表達水平、下調ERK1/2 通路磷酸化水平、抑制Smad2/3 蛋白合成，從而抑制高糖引起的腎小球系膜細胞Col Ⅳ和纖維連接蛋白的合成。研究[32]發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可能通過GPER1 調控足細胞線粒體的穩(wěn)定性。

綜上所述，本研究通過動物模型和體外細胞實驗證實淫羊藿苷可緩解AngⅡ誘導的腎臟纖維化，但其具體作用機制有待進一步明確。因此，本課題組將在后續(xù)研究中進一步探討淫羊藿苷的腎臟保護作用機制，以及該物質的抗纖維化作用是否由GPER1介導產(chǎn)生。