促性腺激素釋放激素拮抗劑上調(diào)小鼠種植窗期子宮自然殺傷 細(xì)胞比例并增強(qiáng)其毒性

周文潔，徐步芳

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心/婦產(chǎn)科，上海 200025

近年來，在體外受精-胚胎移植（in vitrofertilization and enlbryo transfer，IVF-ET）技術(shù)的控制性促排卵方案中，促性腺激素釋放激素拮抗劑（gonadotropin-releasing hormone-antagonist，GnRH-ant）方案的使用呈逐年上升趨勢。大量臨床研究[1]證明，與傳統(tǒng)黃體期長方案相比，GnRH-ant 方案不僅可以減少促性腺激素使用天數(shù)及總用量，降低囊腫及卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生率，還具有較低的周期取消率。然而亦有多項(xiàng)研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，該方案的胚胎植入率、臨床妊娠率均低于長方案，從而限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。同時(shí)，既往針對GnRHant 方案的研究[5-6]顯示，該方案所獲胚胎質(zhì)量并未降低，而其中所使用的GnRH-ant 導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性低下是影響胚胎著床的主要原因。我們前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，在GnRHant 組與自然周期組患者取卵后第7 日（著床期）的子宮內(nèi)膜芯片差異表達(dá)基因中，有部分基因與自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK cell，NK 細(xì)胞）介導(dǎo)的細(xì)胞毒性途徑相關(guān)；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)GnRH-ant 組子宮自然殺傷細(xì)胞（uterine NK cell，uNK cell，uNK 細(xì)胞）的數(shù)量增加，其毒性分子穿孔素（perforin，Pf）的表達(dá)亦增加，繼而提示GnRH-ant 可能通過介導(dǎo)uNK 細(xì)胞的免疫功能影響子宮內(nèi)膜容受性，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎著床率下降。迄今，臨床上尚無改善由GnRH-ant 方案所致的子宮內(nèi)膜容受性低下狀態(tài)的有效藥物?；谇捌谘芯?，我們進(jìn)一步利用GnRH-ant 方案小鼠模型深入分析GnRH-ant 對于母-胎界面免疫及子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控作用機(jī)制，以期為探尋提高拮抗劑方案內(nèi)膜容受性的藥物治療效果提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑及儀器

7 ～8 周齡雌性健康未孕C57BL/6 小鼠16 只[購自上海南方模式生物科技股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2014-0002]，體質(zhì)量20 ～30 g。該實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部SPF 級動物房的標(biāo)準(zhǔn)籠中，動物使用許可證：SYXK（滬）2018-0027。于12 h 晝夜節(jié)律、25 ℃恒溫恒濕條件下，小鼠自由飲水、飲食。所有實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)操作均獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物使用和管理委員會批準(zhǔn)。

注射用醋酸西曲瑞克（GnRH-ant，Merck，德國），人絕經(jīng)期尿促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG，麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司），人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG，麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司）。胞內(nèi)染色試劑盒（BioLegend，美國），Annexin Ⅴ染色試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromodexyuirdine，BrdU，Sigma，美國），Ⅳ型膠原酶（Sigma，美國）。搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），低溫離心機(jī)（Eppendorf，德國），流式細(xì)胞儀（BD，美國）。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中所用抗體，具體信息見表1。

表1 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用抗體Tab 1 Antibodies for flow cytometry

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及小鼠模型建立 連續(xù)觀察2 個(gè)動情周期均正常后，將16 只小鼠隨機(jī)分為對照組和GnRH-ant 組，每組8 只。行小鼠陰道分泌物涂片確定其動情周期，經(jīng)亞甲藍(lán)染色后，顯微鏡下觀察為動情周期第3 日開始，每日向GnRH-ant 組小鼠腹腔注射GnRH-ant（1.5 μg/100 g，連續(xù)7 d）；對照組小鼠則于相同時(shí)間點(diǎn)注射等體積生理鹽水[8]。第7 日，2 組小鼠需再注射HMG（40 U/100 g）；次日，注射HCG（100 U/100 g）48 h 后為小鼠子宮種植窗期，即造模成功。于此時(shí)用頸椎脫臼法處死小鼠，迅速剖腹取出子宮以備后用。

1.2.2 小鼠子宮原代細(xì)胞分離 使用眼科剪將收集的小鼠子宮組織剪碎至約1 mm3碎塊，經(jīng)Ⅳ型膠原酶消化后加入含5%胎牛血清培養(yǎng)液終止消化。后經(jīng)300 目篩網(wǎng)過濾，1 000×g離心5 min 獲得細(xì)胞沉淀，并利用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，待用。

1.2.3 小鼠uNK 細(xì)胞比例及其胞內(nèi)毒性因子檢測 將上述分離的子宮原代細(xì)胞用流式染色緩沖液稀釋為1×106個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。向每個(gè)檢測管中加入100 μL 細(xì)胞懸液，再分別向其中加入2 μg/mL 的抗CD45、抗CD3 和抗NK1. 1 的單克隆抗體進(jìn)行uNK 細(xì)胞表面染色，用以標(biāo)記uNK細(xì)胞，并于4 ℃避光孵育30 min；采用染色緩沖液洗滌2次，加入固定破膜劑，4 ℃固定、打孔30 min；采用透膜緩沖液洗滌2 次，加入抗Pf 和抗Gz-B 抗體，4 ℃避光孵育30 min；而后，再次用染色緩沖液洗滌2 次，于流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.4 uNK 細(xì)胞增殖檢測 于小鼠處死前3 日，每日向每只小鼠腹腔注射BrdU 1 mg，連續(xù)注射3 d。頸椎脫臼處死小鼠后，分離子宮原代細(xì)胞，配置為100 μL 細(xì)胞懸液，并進(jìn)行uNK 細(xì)胞表面染色，經(jīng)固定、破膜（方法同前）后，加入熒光素標(biāo)記的抗BrdU 單克隆抗體，并于4 ℃避光孵育30 min，最終于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測。

1.2.5 uNK 細(xì)胞凋亡檢測 uNK 細(xì)胞表面染色方法同1.2.3 中所述。隨后，采用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒對uNK 細(xì)胞的凋亡進(jìn)行檢測，具體操作參照說明書進(jìn)行，最終于流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行作圖，采用SPSS 21.0 軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用雙尾Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行比較，且實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次及以上。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠uNK 細(xì)胞比例和增殖水平檢測

以CD45、CD3 和NK1.1 標(biāo)記小鼠uNK 細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞術(shù)對2 組小鼠的uNK 細(xì)胞進(jìn)行分析；結(jié)果（圖1A、B）顯示，與對照組相比，GnRH-ant 組小鼠uNK 細(xì)胞比例升高（P=0.000）。采用BrdU 體內(nèi)摻入法檢測GnRH-ant 對uNK 細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果（圖1C、D）顯示，與對照組相比，GnRH-ant 組小鼠uNK 細(xì)胞的增殖水平上調(diào)（P=0.000）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測2 組小鼠uNK 細(xì)胞比例和增殖水平Fig 1 Detection of the proportion and proliferation of mouse uNK cells in the two groups by flow cytometry

2.2 小鼠uNK 細(xì)胞凋亡檢測

以CD45、CD3 和NK1.1 標(biāo)記小鼠uNK 細(xì)胞后，采用熒光標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白 Annexin Ⅴ染色，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測GnRH-ant 對uNK 細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果（圖2） 顯示，與對照組相比，GnRH-ant 組小鼠uNK 細(xì)胞凋亡水平下降（P=0.004）。

2.3 小鼠Pf 及Gz-B 的表達(dá)水平檢測

Pf 和Gz-B 是NK 細(xì)胞發(fā)揮毒性作用的主要細(xì)胞因子，本研究對小鼠uNK 細(xì)胞內(nèi)的這2 個(gè)因子的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）顯示，與對照組相比，GnRH-ant組小鼠uNK 細(xì)胞內(nèi)Pf（P=0.000）和Gz-B（P=0.034）的表達(dá)水平均較高。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測2 組小鼠uNK 細(xì)胞凋亡Fig 2 Detection of the apoptosis of mouse uNK cells in the two groups by flow cytometry

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測2 組小鼠uNK 細(xì)胞中Pf 及Gz-B 的表達(dá)水平Fig 3 Detection of the expression levels of Pf and Gz-B of mouse uNK cells in the two groups by flow cytometry

3 討論

近年來，GnRH-ant 方案憑借其簡便、靈活、安全、有效等優(yōu)勢在輔助生殖領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，但GnRH-ant對內(nèi)膜容受性的不利影響使得該方案的胚胎種植率及臨床妊娠率偏低[2-6]。Macklon 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與自然周期方案組相比，GnRH-ant 方案組子宮內(nèi)膜中多種與細(xì)胞黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及T 細(xì)胞受體信號通路相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化。另外，Ruan 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，注射GnRH-ant 的小鼠種植窗期子宮內(nèi)膜白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和整合素β3（integrin β3）的表達(dá)均有下調(diào)，繼而推測GnRH-ant 方案可能通過作用免疫細(xì)胞功能影響子宮內(nèi)膜容受性，但其相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步探索。

我們通過臨床研究[11]證實(shí)，針對卵巢儲備功能正常的患者，靈活降低拮抗劑方案中GnRH-ant 的用量可增加臨床妊娠率；從而提示，GnRH-ant 對于子宮內(nèi)膜容受性的不利影響與劑量相關(guān)。另外，我們的前期研究[7]還發(fā)現(xiàn)，相比于長方案組及自然周期組，GnRH-ant 組患者在著床期的uNK 細(xì)胞數(shù)量有所增加，Pf 表達(dá)上調(diào)，且其兩者均與GnRH-ant 劑量呈正相關(guān)；繼而表明，GnRH-ant可增加子宮內(nèi)膜uNK 細(xì)胞的數(shù)量并發(fā)揮毒性作用。uNK細(xì)胞是母-胎界面免疫細(xì)胞中占比最高的淋巴細(xì)胞，在正常妊娠過程中該細(xì)胞毒性較低，可通過表面受體識別滋養(yǎng)細(xì)胞，分泌干擾素（interferon，IFN）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、LIF 等有利于滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、血管重塑，在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性及維持正常妊娠中發(fā)揮重要作用[12-13]。在正常月經(jīng)周期和妊娠期間，uNK 細(xì)胞在免疫細(xì)胞中的比例將發(fā)生變化，即月經(jīng)周期中分泌期uNK 細(xì)胞的比例較增生期顯著增加，妊娠期間早孕期蛻膜NK 細(xì)胞比例也隨孕周的增加明顯上升。除比例改變外，uNK 細(xì)胞還可通過細(xì)胞毒性分子如Pf、Gz-B等介導(dǎo)的顆粒胞吐途徑發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[12-13]。當(dāng)母體出現(xiàn)異常炎癥反應(yīng)或免疫增強(qiáng)時(shí)，可激活uNK 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞毒性作用，繼而誘發(fā)胚胎著床失敗、流產(chǎn)甚至早產(chǎn)、子癇前期等病理妊娠結(jié)局[12-13]。相關(guān)研究[14]已證實(shí)，部分不孕癥和復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者的uNK 細(xì)胞數(shù)量明顯 較高。

本研究結(jié)果表明，與對照組相比，GnRH-ant 組小鼠著床期uNK 細(xì)胞增殖水平提升，凋亡水平下降，導(dǎo)致該細(xì)胞比例明顯高于對照組，同時(shí)該組小鼠uNK 細(xì)胞內(nèi)Pf及Gz-B 的表達(dá)水平也明顯升高，繼而提示GnRH-ant 組小鼠uNK 細(xì)胞毒力較強(qiáng)。該結(jié)果與接受拮抗劑方案促排患者的子宮內(nèi)膜表現(xiàn)相符，從而說明接受拮抗劑促排小鼠或可作為研究GnRH-ant 影響母-胎界面免疫功能及子宮內(nèi)膜容受性的較好模型。未來，我們將在此小鼠模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入分析GnRH-ant 影響uNK 細(xì)胞比例及毒性的調(diào)控機(jī)制。例如既往研究[15]報(bào)道GnRH-ant 可抑制患者內(nèi)膜同源盒基因A10（HOXA-10）表達(dá)；HOXA-10可作為子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性分子及重要功能分子，對uNK細(xì)胞功能分化具有一定的調(diào)控作用[7,12,15]；另有研究[16]發(fā)現(xiàn)敲除HOXA-10能通過促進(jìn)T 細(xì)胞增殖誘導(dǎo)免疫失衡等。同時(shí)，我們還將在后續(xù)研究中借助動物模型進(jìn)一步闡明GnRH-ant 通過下調(diào)HOXA-10等途徑影響子宮免疫細(xì)胞包括uNK 細(xì)胞的比例及毒性作用的相關(guān)機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索改善IVF 拮抗劑方案患者子宮內(nèi)膜容受性的臨床藥物治療靶點(diǎn)。

參·考·文·獻(xiàn)

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