茯苓多糖HPLC 指紋圖譜與免疫活性的相關分析

肖 穎， 吳夢琪， 張文清， 徐志珍， 夏 瑋

（華東理工大學化學與分子工程學院， 上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237）

茯苓（Poria cocos）是一種高等擔子菌，寄生于松科植物的根莖上，埋于土壤下繁衍而成。茯苓是傳統(tǒng)藥食兩用中藥，有多個入藥部位，藥用茯苓指的是茯苓的干燥菌核，多為不規(guī)則、大小不一的白色塊狀。多糖是茯苓的主要成分，具有多種生物活性。根據(jù)分步提取的方法，可以從茯苓中分離出6 種多糖[1]，分別命名為PCS1、PCS2、PCS3-I、PCS3-II、PCS4-I 和PCS4-II。其中PCS1、PCS2 和PCS3-I 是含有D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-巖藻糖和D-木糖的雜多糖。PCS3-II、PCS4-I 和PCS4-II 主要由（1→3）-β-D-葡聚糖主鏈和少量（1→6）-β-D-葡聚糖支鏈組成[2]。茯苓多糖（PCPs）具有免疫調(diào)節(jié)的作用，有研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖不僅能促進小鼠T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞的增殖以及增強小鼠巨噬細胞的吞噬能力，還能刺激免疫細胞釋放免疫因子，顯著提高小鼠體液免疫和細胞免疫的能力。茯苓多糖無論是在藥用臨床領域還是食品保健品領域都具有廣闊的應用前景。

多糖的生物活性與多糖的糖基組成、糖苷鍵類型、糖基連接順序、支鏈情況、相對分子質(zhì)量以及特定的空間構象等有著密切的關系[6]。在研究單糖組成對免疫活性的影響時，不能僅憑單糖的含量判斷，將含量較高的單糖成分認定為對免疫活性貢獻最大的成分，而應該通過數(shù)學建模的方法將指紋圖譜色譜峰與生物活性數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析，從而研究各組分對生物活性的貢獻大小。用于相關性分析的數(shù)學建模方法有很多，其中常用的是灰色相關度分析[7]、典型相關分析[8]、主成分分析[9]、多元線性回歸分析[10]以及偏最小二乘法等[11]。正交偏最小二乘法在偏最小二乘法的基礎上結合了正交信號修正法，消除了與因變量無關的數(shù)據(jù)信息，不僅提高自變量與因變量的相關性，而且使得整個模型更加簡潔可靠[12]。

本文通過將茯苓多糖單糖組成的指紋圖譜與小鼠巨噬細胞釋放的NO 的量相結合，采用正交偏最小二乘回歸分析的方法，建立色譜指紋圖譜與免疫活性之間的相關性模型。通過單糖組成的差異來反映各多糖含量的差異，研究單糖組成與免疫活性的相關性，根據(jù)相關系數(shù)的大小研究影響免疫活性的關鍵特征成分，為建立茯苓的質(zhì)量控制方法提供科學依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜（HPLC，安捷倫科技（中國）有限公司）；VS-840-1 超凈工作臺（上海博訊實業(yè)公司）；AE24 分析天平（梅特勒-托利多公司）；R-201 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；Multiskan FC 酶標儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；HF90 二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學儀器公司）；HHS6 恒溫水浴（上海精宏實驗設備公司）；TL-18M 臺式高速冷凍離心機（上海市離心機械研究所）；Scient2-10N 冷凍干燥機（上海新芝生物科技股份公司）。

1.2 原料與試劑

1.2.1 試劑 乙腈（HPLC 級，Adamas 公司）；無水乙醇（分析純，天津大茂化學試劑廠）；無水甲醇（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；三氟乙酸（TFA，Adamas 公司）；三氯甲烷（分析純，國藥集團藥業(yè)股份有限公司）；衍生化試劑 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，Adamas 公司)。單糖對照品：甘露糖(Man)、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、巖藻糖（Fuc）、氨基葡萄糖（GlcN）和木糖（Xyl），均購于上海源聚生物科技有限公司；葡萄糖(Glc，上?；瘜W試劑公司)；半乳糖醛酸（GalA，F(xiàn)luka 公司）；葡萄糖醛酸(GlcA，Aladdin 公司)；RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國GIBCO 公司）; 胎牛血清（美國GIBCO 公司）; 磷酸鹽緩沖液（美國GIBCO公司）；脂多糖（LPS）（美國Sigma 公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（美國Sigma 公司）；一氧化氮檢測試劑盒E1030（普利萊基因技術有限公司）。

1.2.2 原材料產(chǎn)地 茯苓樣品分別來源于云南、安徽、河北、河南、湖南、四川、福建等7 個產(chǎn)地，見表1。

1.2.3 實驗細胞 實驗用細胞株：小鼠巨噬細胞系RAW 264.7，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 實驗方法

2.1 茯苓多糖的提取

將茯苓烘干、粉碎、過篩后待用。按料液比（原料質(zhì)量與溶劑體積之比，g/mL）1∶10 加入體積分數(shù)為95%的乙醇溶液進行脫脂，在85 ℃的水浴鍋中加熱回流4 h。脫脂后濾渣置于烘箱中干燥。稱取50 g濾渣，按料液比1∶10 加入500 mL的雙蒸水，在90 ℃的水浴中提取2 次，提取時間為2 h，將濾液合并，濃縮至30 mL，然后加入4 倍體積的無水乙醇，混合均勻后放置在4 ℃的冰箱里過夜，使多糖沉淀下來。離心后去除上清液，冷凍干燥后得到茯苓多糖。

表 1 原材料批次與產(chǎn)地Table 1 Sample batches and place of origin

2.2 單糖組成分析

取6 mg 多糖樣品于安瓿瓶中，加入2 mol/L TFA 2 mL，使其充分溶解。封管后在120 ℃的烘箱中水解4 h，冷卻至室溫，加入適量甲醇在40 ℃下減壓旋蒸至干，重復此操作7～8 次，除去過量的TFA，得到水解產(chǎn)物，用雙蒸水溶解后備用。

配制1 mg/mL 的混合單糖標準液，取水解后的樣品和單糖標準液各0.5 mL，加入0.6 mol/L NaOH溶液0.5 mL，混合均勻后，再加入0.5 mol/L PMP 的甲醇溶液1 mL，置于70 ℃烘箱中反應100 min。冷卻至室溫后用鹽酸溶液中和，最后將中和后的溶液用氯仿萃取3 次，棄去氯仿相，水相用0.45 μm 微孔膜過濾后供HPLC 進樣分析。

采用Agilent 1260 HPLC 儀進行分析，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，進樣量為10 μL，流動相為乙腈和0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)，其體積比為18∶82；檢測器二級陣列管檢測器(DAD)，檢測波長250 nm。

2.3 茯苓多糖指紋圖譜建立

分別取16 批不同產(chǎn)地的茯苓多糖各6 mg，按2.2 節(jié)的方法獲得不同產(chǎn)地茯苓多糖單糖組成的HPLC 譜圖，將色譜數(shù)據(jù)依次導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A）軟件，得到指紋圖譜。

2.4 多糖完全酸水解產(chǎn)物分析方法的考察

2.4.1 穩(wěn)定性實驗 將衍生化后的同一樣品放置0、4、8、12、24 h 后，測定單糖組成及含量，考察該方法的穩(wěn)定性。

2.4.2 重復性實驗 對同一批次樣品取5 份，分別進行水解、衍生化、中和萃取等操作，制備得到平行的5 份供試液，測定單糖組成及含量，考察單糖分析方法的重復性。

2.4.3 儀器精密度實驗 取9 個單糖混合標準品的衍生溶液連續(xù)進樣5 次，比較各個共有峰的保留時間和峰面積，考察儀器的精密度。

2.5 MTT 法測試細胞相對存活率

取對數(shù)生長期密度為每毫升104個的RAW 264.7細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，分成濃度分別為12.5、25、50、100、200、400、600、800、1 000、2 000 μg/mL共10 個劑量的茯苓多糖處理組和培養(yǎng)基培養(yǎng)的空白對照組，每個組別設置6 個復孔，各孔加液體積為200 μL；置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，每孔加入30 μL MTT (0.5 mg/mL)的磷酸鹽緩沖溶液，相同條件避光孵育4 h 后吸去各孔液體，加入200 μL 二甲基亞砜溶液溶解生成的結晶物，靜置10 min 后，使用酶標儀于492 nm 波長處測定各孔OD 值，計算細胞相對存活率。

2.6 Griess 法測定NO 的濃度[13]

取對數(shù)生長期的RAW 264.7 細胞制成細胞懸液，密度為每毫升105個細胞，接種于96 孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5% 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，將茯苓多糖用培養(yǎng)基分別稀釋為質(zhì)量濃度50、100、200 μg/mL，每孔加入200 μL，每個濃度設4 個復孔，陽性對照組加入同體積0.1 μg/mL LPS（脂多糖），培養(yǎng)24 h。采用Griess 法測定NO 濃度：吸取50 μL 培養(yǎng)基，之后加入50 μL Griess I 試劑，靜置后，加入50 μL Griess II試劑。用酶標儀測試492 nm 處的吸光度（OD）。

3 結果與討論

3.1 茯苓多糖指紋圖譜

16 批不同產(chǎn)地茯苓多糖構建的指紋圖譜如圖1所示。不同產(chǎn)地樣品的液相色譜圖相似度較高，有8 個共有峰。將各批茯苓多糖色譜數(shù)據(jù)導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A），以S1 藥材的HPLC 圖譜作為參照譜，采用mark 峰匹配的方法，選中所有共有峰，建立茯苓多糖的對照指紋圖譜，見圖2中a。通過和9 種單糖標準品混合液的衍生化色譜圖（圖2 中b）比對，確定8 個共有峰分別為甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖。其中甘露糖、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖的含量較高，峰面積占比之和超過98%；而氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖和阿拉伯糖的含量很低。各產(chǎn)地茯苓多糖的單糖組成與對照指紋圖譜相一致，但不同單糖的相對比例有較小差異。不同產(chǎn)地樣品和對照指紋圖譜的相似度分析結果如表2 所示，相似度在0.980～1.000 之間，表明各產(chǎn)地茯苓多糖之間差異較小，可以采用建立的指紋圖譜評價茯苓多糖的質(zhì)量。

圖 1 16 批茯苓多糖的指紋圖譜Fig. 1 Fingerprints of 16 groups of PCPs

3.2 分析方法考察結果

單糖組成及含量的實驗結果表明，樣品各共有峰峰面積相對標準偏差(RSD) 小于4.2%，保留時間的RSD 小于2%，表明檢測方法在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

圖 2 茯苓多糖完全酸水解產(chǎn)物的對照指紋圖譜（a）及混合單糖標準品的高效液相圖譜（b）Fig. 2 Control fingerprints of complete acid hydrolyzate of PCPs (a) and HPLC of mixed monosaccharide (b)

表 2 16 批茯苓多糖相似度分析結果Table 2 Results of similarity of 16 groups of PCPs

用HPLC 分析單糖組成及含量，各共有峰峰面積的RSD 值小于6.2%，保留時間的RSD 值小于0.9%，表明檢測方法的重復性良好。

對9 個單糖混合標準品的衍生溶液連續(xù)進樣5次，比較各共有峰的保留時間和峰面積，各共有峰峰面積的RSD 小于0.12%，保留時間的RSD 小于1.4%，表明該儀器具有良好的精密度。

3.3 細胞相對存活率

采用MTT 法測定RAW 264.7 細胞的相對存活率，若細胞在一定濃度范圍內(nèi)的相對存活率≥85%，則認為該濃度范圍的茯苓多糖沒有細胞毒性。由圖3 可知，當茯苓多糖的質(zhì)量濃度范圍為0～600 μg/mL時，RAW 264.7 細胞的相對存活率在0.87～1.15 之間，該濃度范圍內(nèi)的茯苓多糖對RAW 264.7 細胞無細胞毒性，且當茯苓多糖質(zhì)量濃度為 100～200 μg/mL 時，細胞的相對存活率>1，表現(xiàn)為促進細胞增長。

圖 3 茯苓多糖不同質(zhì)量濃度時細胞的相對存活率Fig. 3 Relative cell survival rate with the different mass concentration of PCPs

3.4 巨噬細胞釋放NO 的濃度

NO 是體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，不僅是細胞間、細胞內(nèi)的信號分子，而且在免疫學上也具有重要的意義。它作為機體非特異性免疫系統(tǒng)的組成部分之一，起著免疫效應分子和免疫調(diào)節(jié)劑的作用。Griess法是測定NO 濃度最常用的方法，測試結果如表3 所示，在茯苓多糖的質(zhì)量濃度范圍為50～200 μg/mL時，實驗組細胞產(chǎn)生NO 濃度隨茯苓多糖質(zhì)量濃度的增加而增加。圖4 將實驗組、空白組和陽性對照組細胞產(chǎn)生的NO 濃度進行對比，可見空白組細胞產(chǎn)生的NO 濃度最低，為（12.96±0.50）μmol/L，陽性對照組（LPS）細胞產(chǎn)生的NO 濃度最高，為（27.86±0.84）μmol/L，質(zhì)量濃度為100 μg/mL 和200 μg/mL 的茯苓多糖與空白組相比均有顯著性（P<0.01），且各實驗組NO 濃度均低于陽性對照組。對比不同產(chǎn)地茯苓多糖的免疫活性，可以看出云南、安徽等地的茯苓多糖刺激小鼠巨噬細胞后產(chǎn)生的NO 濃度相對較高，免疫活性普遍優(yōu)于其他產(chǎn)地的茯苓多糖。

表 3 16 批茯苓多糖刺激RAW264.7 細胞釋放的NO 濃度Table 3 NO concentration of RAW264.7 cells from 16 groups of PCPs

3.5 茯苓多糖的單糖組成與免疫活性的相關性分析

正交偏最小二乘回歸是一種用于相關性分析的方法，它結合了典型相關分析、主成分分析以及多元相關分析的特點，適用于自變量存在自相關或樣本數(shù)量較少時的數(shù)據(jù)分析，可以很好地彌補其他分析方法的不足。以各單糖峰面積（AX1～AX8，其中X1～X8 分別表示甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖）作為自變量，NO 的釋放量（Y）作為因變量，茯苓多糖色譜指紋圖譜及免疫活性的數(shù)據(jù)矩陣見表4，將表4 中數(shù)據(jù)導入SIMCA 14.1 軟件中采用正交偏最小二乘法進行數(shù)據(jù)分析[14]，得到自變量的回歸系數(shù)見圖5，回歸系數(shù)反映了每種單糖與免疫活性之間相關性的大小，系數(shù)的絕對值越大，說明相關性越大，系數(shù)的符號反映了自變量與因變量是呈正相關還是負相關[15]。擬合出回歸方程為Y=1.59AX1?1.28AX2?0.54AX3+0.41AX4+3.32AX5?0.53AX6+1.89AX7?5.51AX8。由方程可知，各單糖含量與小鼠巨噬細胞產(chǎn)生NO 的濃度之間的相關性大小為：巖藻糖>半乳糖>阿拉伯糖>甘露糖>氨基葡萄糖>葡萄糖醛酸>木糖>葡萄糖。其中，半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖與免疫活性呈正相關，而巖藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和木糖與之呈負相關。圖6 示出了茯苓多糖的VIP （Variable impor tance in projection）值，VIP 值反映了自變量對因變量貢獻的大小，一般認為VIP>1 的自變量對模型有顯著性的貢獻。在該模型中，葡萄糖、半乳糖和甘露糖的VIP 值均大于1，說明其對刺激小鼠巨噬細胞釋放NO 發(fā)揮重要作用。

圖 5 標準化回歸系數(shù)Fig. 5 Normalized regression coefficient diagram

圖 6 茯苓多糖的VIP 值Fig. 6 VIP of PCPs

4 結 論

（1）茯苓多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖以及少量的氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、阿拉伯糖組成。通過水解并衍生，將16 批不同產(chǎn)地的茯苓多糖的HPLC 色譜圖建立指紋圖譜。相似度分析結果表明16 批樣品的相似度很高，均在0.981～1.000 之間。

（2）進行免疫活性的測定，各實驗組NO 釋放濃度均高于空白對照組，且NO 的釋放濃度隨著茯苓多糖濃度的增大而增大。

（3）通過正交偏最小二乘法擬合出回歸方程，根據(jù)自變量的回歸系數(shù)可判斷出半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖與小鼠巨噬細胞的免疫活性呈正相關；巖藻糖、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和木糖與免疫活性呈負相關，其中葡萄糖、半乳糖和甘露糖對免疫活性具有顯著貢獻。

（4）本文初步研究了茯苓多糖指紋圖譜與小鼠巨噬細胞NO 的釋放量之間的關系，為科學地制定茯苓多糖的質(zhì)量評價標準提供參考。