鵝源性沙門(mén)氏菌分離鑒定及中藥抑菌效果分析

岳學(xué)青，高炳南，周瑞進(jìn)，王秋菊，崔一喆

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

鵝沙門(mén)氏菌病又稱(chēng)為鵝副傷寒，為革蘭氏陰性菌感染，其傳播迅速致病率高，發(fā)病鵝往往生產(chǎn)性能低下甚至引起死亡給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。臨床剖檢可見(jiàn)肝臟腫大并伴隨出血現(xiàn)象，盲腸充滿(mǎn)白色分泌物[1]。據(jù)劉敏芳[2]做的鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染鵝的實(shí)驗(yàn)可知感染的6只鵝2 d內(nèi)死亡4只可見(jiàn)沙門(mén)氏菌病在鵝養(yǎng)殖業(yè)的危害是巨大的。目前對(duì)細(xì)菌性疾病的診斷主要通過(guò)細(xì)菌分類(lèi)鑒定生化實(shí)驗(yàn)以及較為準(zhǔn)確的PCR[3]。近年來(lái)由于抗生素的無(wú)節(jié)制使用造成細(xì)菌演化出多重耐藥菌株，其耐藥性越來(lái)越強(qiáng)給人類(lèi)生產(chǎn)活動(dòng)尤其是食品衛(wèi)生方面帶來(lái)了很大危機(jī)[4]。而中藥卻具備綠色，環(huán)保，長(zhǎng)期使用不易產(chǎn)生耐藥菌株的特點(diǎn)，所以在近年國(guó)家大力提倡禁止使用抗生素的大環(huán)境下，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始在中藥抑菌方面做出探索。例如司春燦[5]在不同中藥對(duì)大腸桿菌的研究中提到不同提取方式對(duì)中藥抑菌效果的影響。趙娜[6]在黃連等六味中藥對(duì)耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌作用研究中提到中藥具有良好的抑菌效果。另外中藥在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡方面具有良好前景，例如肉豆蔻酸可以誘導(dǎo)乳腺癌癌細(xì)胞、前列腺癌癌細(xì)胞、胃癌癌細(xì)胞、肝癌癌細(xì)胞等。并且在Xiangrong Chen[7]的研究中證明了肉豆蔻具備破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，破壞細(xì)菌DNA使其裂解，從而降低耐藥性的作用。在Q.Y.Zhao等[8]研究報(bào)道中黃芩可以降低細(xì)菌耐藥基因的表達(dá)以此來(lái)降低細(xì)菌耐藥性。在食品添加劑方面，中藥作為一種天然的食品防腐劑，很少被用作食品添加劑。研究可以為中藥作為天然食品防腐劑的研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑

亞硫酸鉍瓊脂（BS）、血平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）、腸道菌增菌肉湯（EE）、PCR儀、球磨儀、恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（?；锟萍加邢薰荆⑴＝虮?、紫外分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)藥物

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株的制備及培養(yǎng)

為了更好實(shí)施臨床對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌的特異性調(diào)控，在病原體的識(shí)別提取方面就顯得尤為重要。試驗(yàn)所用菌株采集于黑龍江省獅白鵝發(fā)病幼鵝的新鮮糞便。準(zhǔn)備6支無(wú)菌試管分別標(biāo)記上10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。稱(chēng)取 1 g 新鮮糞便于 10-1號(hào)試管內(nèi)，并在6支試管內(nèi)分別加入9 mL PBS。充分混勻后10-1號(hào)試管后吸取100μL置于10-2號(hào)管內(nèi)充分混勻再吸取100μL到下一個(gè)管以此類(lèi)推，至10-6號(hào)管，舍去100μL。稀釋好的菌液進(jìn)行特異性培養(yǎng)，取3個(gè)無(wú)菌平養(yǎng)皿制備亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基（BS）分別標(biāo)記10-4、10-5、10-6分別吸取對(duì)應(yīng)試管內(nèi)稀釋的菌液20μL用玻璃棒進(jìn)行涂布此過(guò)程在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h觀察生長(zhǎng)情況。將優(yōu)勢(shì)沙門(mén)氏菌株接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面37℃恒溫培養(yǎng)12 h。并制備含菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板觀察其菌落狀態(tài)。從瓊脂斜面上勾取優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行血平皿涂板及革蘭氏染色鏡檢。

2.2 中藥的制備

根據(jù)白東東等[9]對(duì)中藥提取的報(bào)道，現(xiàn)將黃芩、訶子等25味中藥進(jìn)行研磨粉碎。稱(chēng)取3 g藥粉于無(wú)菌試管內(nèi)，加入70%酒精30 mL常溫過(guò)夜。次日將浸泡好的中藥400 W超聲波震碎30 min，1 200 rpm離心10 min取上清，70℃～80℃水浴濃縮至3 mL，121℃高壓滅菌15 min 4℃冷藏保存。

2.3 PCR法鑒定

2.3.1 引物的設(shè)計(jì)及合成

引物依據(jù)王警等[10]報(bào)道的引物合成方法，即根據(jù)GenBank所提供的沙門(mén)氏菌的基因序列，在生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)純度級(jí)別為PAGE。設(shè)計(jì)出的上游引物命名為：InvAF5’AAA AGA AGG GTCGTCGTT AG 3’下游引物命名為 InvAR：5’GGA AGG TAC TGC CAG AGG TC3’。

2.3.2 PCR擴(kuò)增的DNA模板

將各致病菌株分別接種到腸道菌增菌肉湯培養(yǎng)基中，37℃，160 rpm搖床過(guò)夜培養(yǎng)，使菌液終濃度達(dá)到1×108CFU·mL-1。吸取培養(yǎng)好的菌液5 mL，10 000 rpm離心5 min盡量吸取上清丟棄，依據(jù)HaiGene?；锟萍加邢薰咎峁┑募?xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)鵝源沙門(mén)氏菌的DNA進(jìn)行提取，提取沙門(mén)氏菌DNA作為熒光定量PCR模板，也可直接選用菌液作為PCR的模板，存放于-20℃。

2.3.3 PCR體系

試驗(yàn)的PCR體系為20μL如表1所示。

1.2.2 問(wèn)卷調(diào)查 采用護(hù)士工作滿(mǎn)意度量表(中文版)［2］，包含15個(gè)項(xiàng)目的Likert量表，答案分為5個(gè)級(jí)別，即“非常不滿(mǎn)意、不滿(mǎn)意、一般、滿(mǎn)意和非常滿(mǎn)意”，分別按1～5分計(jì)分，得分越高表示滿(mǎn)意度越高。該量表的信度(Cronbach’α系數(shù))為0.88。每次應(yīng)急人力調(diào)配后1周，由護(hù)理部科研成員對(duì)相關(guān)科室護(hù)士講解測(cè)試目的后填寫(xiě)問(wèn)卷，并當(dāng)場(chǎng)收回。共發(fā)出問(wèn)卷171份，回收問(wèn)卷171份，回收率100%。

2.3.4 PCR擴(kuò)增程序

如表2所示為試驗(yàn)PCR的反應(yīng)程序。

2.3.5 PCR產(chǎn)物的鑒定

用1×TAE緩沖液加EB（熒光素，溴化乙錠）1μL配制質(zhì)量濃度為0.1 g·L-1的瓊脂糖凝膠。吸取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2μL，buffer 0.5μL混合后加入瓊脂糖凝膠孔內(nèi)，電泳30 min。用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳結(jié)果，分離菌株與預(yù)期條帶 345 bp左右一致，即為沙門(mén)菌陽(yáng)性[11]。

表1 PCR擴(kuò)增體系Table1 PCR amplification system

表2 PCR反應(yīng)程序Table2 PCR reaction procedure

2.4 沙門(mén)氏菌的游離性鑒定

勾取瓊脂斜面上的沙門(mén)氏菌于改良MSRV培養(yǎng)基上42℃恒溫培養(yǎng)12 h。觀察其是否有游離性。

2.5 菌懸液的制備及菌濃度的確定

勾取瓊脂斜面上單株菌落接種于腸道菌增菌肉湯內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)好的菌液進(jìn)行40倍、50倍、60倍、70倍等梯度稀釋。使用紫外分光光度計(jì)將菌液濃度調(diào)定為1×105CFU·mL-1。吸取稀釋好的菌液與等量甘油1∶1進(jìn)行混合，-80℃保存。

2.6 各類(lèi)中藥的MIC

試驗(yàn)采用傳統(tǒng)的二倍稀釋法，準(zhǔn)備好96無(wú)菌培養(yǎng)孔板，先在第1列加入180μL腸道菌增菌肉湯（EE），在第12列加入200μL腸道菌增菌肉湯（EE）。在2-11列加入100μL腸道菌增菌肉湯（EE）。將保存?zhèn)溆玫母鞣N中藥提取液20μL分別加入到第一列，用排槍充分吹吸混勻后吸取100μL混合液到第二列，第二列混勻后再吸取100μL至第三列，直到第10列混勻后吸取100μL舍去。第1-11列放入稀釋好的菌懸液100μL。此時(shí)無(wú)菌培養(yǎng)板中第 1～10 列中藥濃度分別為 50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39、0.20、0.10 mg·mL-1。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。第11列為陽(yáng)性對(duì)照組（添加培養(yǎng)基和菌懸液），第12類(lèi)為陰性對(duì)照（僅培養(yǎng)基）。將肉眼觀察最清亮孔的最小濃度定義為最小抑菌濃度（MIC）。若96孔板上出現(xiàn)跳孔則操作不正確需要重新進(jìn)行試驗(yàn)。每類(lèi)中藥做3次重復(fù)。

2.7 牛津杯法體外抑菌試驗(yàn)

依據(jù)劉德成[12]提供的牛津杯法抑菌試驗(yàn)：無(wú)菌條件下制備N(xiāo)A培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻后，吸取20μL菌懸液均勻涂抹于平板上靜置1h制成含菌平板。用鑷子夾住牛津杯放在酒精燈外焰上灼燒，待牛津杯上的冷煙由下向上走過(guò)即可平穩(wěn)的將其置于含菌培養(yǎng)基上，其內(nèi)加入80μL藥液，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，測(cè)量其直徑。抑菌圈直徑＞15 mm為高敏，10 mm≤抑菌圈直徑≤15 mm為中敏，抑菌圈直徑＜10 mm為不敏感或耐藥。

3 結(jié)果

3.1 菌株在各培養(yǎng)皿上的生長(zhǎng)狀態(tài)

沙門(mén)氏菌在亞硫酸鉍瓊脂（BS）上生長(zhǎng)為黑色菌落有金屬光澤，菌落光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊圓形如圖1，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿上生長(zhǎng)為無(wú)色大菌落，光滑圓潤(rùn)，半透明，乳白色，這與李柏林[13]所報(bào)道的一致。如圖2所示。在改良MSRV培養(yǎng)基上有白色遷移現(xiàn)象如圖3所示。在血平板上生長(zhǎng)出現(xiàn)溶血環(huán)如圖4。經(jīng)革蘭氏染色鵝沙門(mén)氏菌為紅色，革蘭氏陰性菌，多呈散狀存在如圖5。根據(jù)幾種培養(yǎng)基的特異性培養(yǎng)初步鑒定為本次所提取的菌株為鵝源性沙門(mén)氏菌。

圖1 亞硫酸鉍瓊脂（BS）Fig.1 Growth of bacteria on bismuth sulfite agar

圖2 營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）Fig.2 Growth of bacteria on nutrien agar

圖3 改良MRSVFig.3 Growth of bacteria on Improved MRSV

圖4 血平板Fig.4 Growth of bacteria on Blood plate

圖5 細(xì)菌革蘭氏染色Fig.5 Schematic diagram of bacterial Gram staining

3.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

如圖6所示，第M孔為Marker，第1～2為菌通用型引物擴(kuò)增條帶。第3孔和第4孔為試驗(yàn)特異性沙門(mén)條帶：經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后，送公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性在線(xiàn)比對(duì)，以此確定菌種屬種。結(jié)果顯示特異性純化的菌為鼠傷寒沙門(mén)氏菌。

圖6 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖Fig.6 AGEresult

3.3 各類(lèi)中藥MIC

如表3所示：在25種中藥試驗(yàn)中五倍子、訶子、烏梅、黃連、防風(fēng)、辛夷對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌擁有良好的抑菌效果。絕大多數(shù)中藥都在試驗(yàn)中對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出抑菌性，因?yàn)槊糠N中藥的炮制方法不同各種成分的提取量也不盡一致。故試驗(yàn)統(tǒng)一采用了酒浸的方式雖然部分中藥效果不是很好，但這不足以說(shuō)明這幾種中藥對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌抑菌效果不好，只能說(shuō)明在酒浸這種炮制方式下這幾種中藥對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌的抑菌效果不如五倍子、訶子、烏梅、黃連、防風(fēng)、辛夷這幾味中藥。

表3 中藥藥敏試驗(yàn)Table 3 TCMdrug susceptibility test

3.4 牛津杯體外抑菌效果

由表4可知五倍子、烏梅、訶子、防風(fēng)、黃連、車(chē)前子對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌呈現(xiàn)高度敏感。野菊花、黃芩、辛夷對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌呈現(xiàn)中度敏感。知母呈現(xiàn)低度敏感。

4 討論與分析

試驗(yàn)從中藥抑菌角度出發(fā)，進(jìn)行了菌的鑒定及中藥的酒浸提取物抑菌試驗(yàn)。結(jié)果顯示中藥在抑制鵝源性沙門(mén)氏菌上是普遍有效果的。其中五倍子、烏梅、訶子、防風(fēng)等對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌呈現(xiàn)出較高的敏感度。野菊花，黃芩等則表現(xiàn)出中度抑菌敏感。雖然在體外抑菌實(shí)驗(yàn)中，中藥在對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌表現(xiàn)出良好的抑菌效果，但其并不能代表篩選出的這幾味中藥對(duì)臨床治療的效果。要想知道其臨床治療鵝源性沙門(mén)氏菌引起的疾病的治療效果還需進(jìn)行動(dòng)物性試驗(yàn)。因沙門(mén)氏菌分2 579個(gè)血清型所以中藥在眾多血清型的抑菌效果還有待探討[14]。我國(guó)在探索中藥抑菌方面具有悠遠(yuǎn)的歷史，從20世紀(jì)40年代開(kāi)始，就有無(wú)數(shù)的中藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)不斷地開(kāi)展，直至現(xiàn)在大量試驗(yàn)的均證明中藥是具有抑菌作用的[15]。另外中藥具有療效好，副作用小，價(jià)格低廉不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，在未來(lái)一定會(huì)被廣泛應(yīng)用[16]。雖然多數(shù)實(shí)驗(yàn)均是在單味中藥的基礎(chǔ)上開(kāi)展的，但中藥來(lái)源廣泛，種類(lèi)繁多。而且眾多的中藥之間的相互配伍是不容忽略的。據(jù)葛海燕[17]在對(duì)中藥對(duì)藏香豬源致病性大腸埃希菌地方流行株中體外抑菌效果試驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定敏感藥物體外聯(lián)合抑菌指數(shù)FICI，結(jié)果表明，訶子、黃連、訶子+白頭翁2種中藥組合對(duì)抑菌效果產(chǎn)生協(xié)同作用，而訶子、五倍子、五味子+黃連、五味子+白頭翁3種中藥的組合對(duì)抑菌效果具有相加作用，因而證實(shí)了這幾種中藥可以組合在一起，提高其抑菌效果。而五味子+五倍子組合有拮抗作用，降低其抑菌效果。證明這兩種中藥是不能聯(lián)合使用的。所以在聯(lián)合用藥方面還需要做進(jìn)一步的研究。近代以來(lái)隨著抗生素的大范圍使用，細(xì)菌出現(xiàn)大量的耐藥菌株。耐藥菌可以通過(guò)防止吞噬細(xì)胞吞噬或消除吞噬細(xì)胞內(nèi)的活性氧等方式來(lái)逃避先天性免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生耐藥性[18]。研究表明藥物抗耐藥菌作用方面具有突出作用的機(jī)制大致可分為以下幾類(lèi)，可通過(guò)消除細(xì)菌內(nèi)有耐藥性基因的質(zhì)粒從而消除細(xì)菌的耐藥性。抑制細(xì)菌外排泵從而降低細(xì)菌耐藥性，還可以通過(guò)改變細(xì)菌的細(xì)胞膜的通透性來(lái)降其耐藥性[19]。在Wooseong Kim[20]報(bào)道的藥物通過(guò)附著、嵌入、滲透進(jìn)入細(xì)菌磷脂雙分子層，從而改變磷脂雙分子層的流動(dòng)性，加速細(xì)胞膜完整性的破壞最終致使細(xì)胞膜破碎，核酸裂解細(xì)菌死亡。在申春紅[21]的益生菌發(fā)酵復(fù)方中草藥對(duì)肉鴨生長(zhǎng)性能和屠宰性能中提到，經(jīng)益生菌發(fā)酵后的中草藥可提高肉鴨的生長(zhǎng)性能和屠宰性能。由此可見(jiàn)在中藥不同炮制方法下藥效及功能都是迥異的，中藥的可開(kāi)發(fā)程度是深遠(yuǎn)的。中藥在治療預(yù)防疾病方面本就有著不可替代的作用，其抑菌機(jī)理的研究和藥物運(yùn)用方面的探索是我們今后研究的重點(diǎn)和方向。

表4 中藥對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌的牛津杯抑菌檢測(cè)結(jié)果Table 4 Antibacterial test resultsof traditional Chinese medicine on Oxford Cup of Goose-derived Salmonella

針對(duì)鵝源性沙門(mén)氏菌病這類(lèi)家禽傳染病其傳染力強(qiáng)，傳播速度快，破壞力強(qiáng)給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)不可估量的損失，在提高預(yù)防措施這方面就顯得尤為重要。為此應(yīng)該從以下幾個(gè)方面進(jìn)行防御措施：第一，提高防疫意識(shí)，加強(qiáng)飼養(yǎng)者和組織管理者的技術(shù)培訓(xùn)，做好防御安全宣傳知識(shí)的到位。第二，制定合理的飼養(yǎng)管理模式，在科學(xué)的理論下知道實(shí)踐并不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)使之達(dá)到規(guī)?；茖W(xué)養(yǎng)殖。第三，加強(qiáng)飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生的管理，及時(shí)清除動(dòng)物糞便等可能滋生細(xì)菌的東西。做好防止鼠類(lèi)鳥(niǎo)類(lèi)等的進(jìn)入飼養(yǎng)環(huán)境造成食源水源的污染。第四，做好防疫工作，及時(shí)合理的對(duì)家禽接種疫苗。