黑龍江省某規(guī)?；翀?chǎng)BVDV病毒分離鑒定及生物學(xué)信息分析

王夢(mèng)心，周玉龍，賈偉強(qiáng)，李旭陽(yáng)，翟海瑞，靳廣杰，胡林杰，孟野，盛守志

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319）

牛病毒性腹瀉/黏膜?。˙ovine viraldiarrhea/mucosal disease，BVD）的病原體是牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）。BVDV 是一種全球分布的病毒，由于其致病機(jī)制復(fù)雜，且缺乏有效的防控技術(shù)，因此BVDV在世界范圍內(nèi)廣泛流行[1]，除了可導(dǎo)致患病動(dòng)物呼吸、消化和生殖系統(tǒng)的臨床癥狀外，宮內(nèi)感染BVDV的胎兒可導(dǎo)致免疫耐受性、持續(xù)性感染（PI）動(dòng)物的出生。這些PI動(dòng)物會(huì)釋放大量的病毒，是傳播BVDV的主要來(lái)源，因此在自然界中很難將其徹底消滅，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在BVDV基因組中，5’-UTR是瘟病毒最保守的基因，約由360～386個(gè)核苷酸組成，通過(guò)自身折疊形成特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)BVDV的基因組的翻譯和復(fù)制[3]，是病毒基因組中高度保守的部分，包括一個(gè)內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，本質(zhì)上與病毒多蛋白的翻譯有關(guān)[4]，E2基因?yàn)镈VBV病毒的囊膜糖蛋白，是瘟病毒中一種高度可變的免疫性糖蛋白，是中和抗體的主要靶點(diǎn)[5]。因此5’-UTR和E2基因均可用于瘟病毒及BVDV的遺傳多樣性分析[6]。近年來(lái)，黑龍江省地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查顯示，BVDV的感染率正在逐年增加[7]，實(shí)驗(yàn)對(duì)黑龍江省某集約化牛場(chǎng)采集到的奶牛呼吸道樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)和遺傳進(jìn)化分析，希望為本地區(qū)的牛病毒性腹瀉粘膜病的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 樣本采集

2018年黑龍江省某規(guī)?；翀?chǎng)爆發(fā)牛呼吸道綜合征，臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽，結(jié)膜發(fā)炎，體溫在41～42℃，鼻中流出黃色膿樣鼻液，精神沉郁和消瘦，發(fā)病率為45%，致死率為20%。實(shí)驗(yàn)室從一頭育成牛身上采集到1份肺部組織作為實(shí)驗(yàn)樣本。

1.2 主要試劑

馬達(dá)氏—牛腎細(xì)胞（MDBK）、雙抗、細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%的胎牛血清）、PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶、維持液、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗（購(gòu)自英國(guó)Abcam公司）、Trizol（購(gòu)自Roche公司），反轉(zhuǎn)錄酶（購(gòu)自TOYOBO公司），Quick Taq（購(gòu)自 TaKaRa公司），DL2 000 maker（購(gòu)自TaKaRa公司），膠回收試劑盒（購(gòu)自O(shè)MEGA公司），瓊脂糖（購(gòu)自BIOWESTE公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純配制。

1.3 引物

（1）實(shí)驗(yàn)所用引物 5’UTR 引物 324/326（324：ATGCCC（T/A）TAGTAGGACTAGCA；326：TCAACTCCATGTGCCATGTAC）是針對(duì)高度保守的5’-UTR序列設(shè)計(jì)的一對(duì)BVDV的特異性引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為 300 bp 左右[8]。

（2）所用E2引物E2R/E2F（E2F：TGGTGGCCTTATGAGAC；E2R：CCCATCATCACTATTTCACC）則是利用Primer5以及Oligo7軟件，在參考Genbank中已發(fā)表的全基因組序列，在進(jìn)行比對(duì)后完成引物設(shè)計(jì)，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為1 400 bp左右[9]。兩種引物均由上海生物工程公司合成。

1.4 5’UTR和E2參考毒株信息

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 病毒分離

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

（1）從液氮罐中取出凍存的MDBK細(xì)胞，浸于37℃溫水中，快速攪拌使凍存細(xì)胞快速融化。

（2）將凍存管放入離心機(jī)中離心1 000 r，5 min后取出放入超凈臺(tái)。吸出上清液，加入新配好的營(yíng)養(yǎng)液輕輕吹吸混勻。用移液器吸出細(xì)胞懸液，加入10 mL的細(xì)胞瓶中，然后加入5 mL的配好的細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞吹吸均勻，放入37℃，2.5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中。

（3）24 h內(nèi)觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞基本長(zhǎng)滿(mǎn)一層后，傾棄瓶?jī)?nèi)的舊營(yíng)養(yǎng)液，加入PBS洗滌2～3遍后，加入1 mL 0.25%胰酶放入37℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行消化，加入新的營(yíng)養(yǎng)液終止消化，用吸管反復(fù)吹吸沒(méi)有脫落的細(xì)胞，直到細(xì)胞吹散，進(jìn)行傳代，37℃CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。

2.1.2病毒樣本處理

將收集到的病料進(jìn)行處理，病料組織3次凍融之后，加維持液進(jìn)行研磨，收集研磨液，離心12 000 r，5 min，吸取上清液，使用 0.22μm 進(jìn)行過(guò)濾，-80℃保存。

2.1.3 病毒分離

（1）將長(zhǎng)滿(mǎn)單層細(xì)胞的細(xì)胞瓶取出，傾倒舊液，用PBS洗滌2～3次，將收集到的BVDV樣本處理液取1 mL接到MDBK細(xì)胞，37℃吸附1 h，期間每隔15 min輕輕搖晃細(xì)胞瓶，確保樣本處理液均勻接觸細(xì)胞。

（2）處理將接種的病毒液倒入廢液缸中，加入5 mL DMEM維持液，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將病毒盲傳三代，每天對(duì)接毒細(xì)胞和對(duì)照組進(jìn)行觀(guān)察，看是否出現(xiàn)病變，120 h后對(duì)接毒細(xì)胞進(jìn)行收毒。

2.2 病毒鑒定

2.2.1 CPE觀(guān)察

觀(guān)察細(xì)胞病變情況，根據(jù)觀(guān)察到的細(xì)胞是否病變進(jìn)行分類(lèi)，在接毒后120 h或病變超過(guò)70%進(jìn)行收毒，沒(méi)有病變的細(xì)胞也收毒，做后續(xù)提取RNA的實(shí)驗(yàn)的樣本。

2.2.2 間接免疫熒光鑒定

（1）將收毒后的病毒接種到長(zhǎng)滿(mǎn)單層細(xì)胞的MDBK的12孔板中，接種3孔，同時(shí)設(shè)立MDBK陰性對(duì)照，約48 h后，用預(yù)冷的50%丙酮固定30 min，PBS沖洗3遍。

（2）按100μL·孔-1加入BVDV單克隆抗體為一抗（稀釋 1∶100），37 ℃恒溫箱孵育 1 h，PBS洗 3遍，5 min一次，輕輕搖勻，充分清洗。

（3）按200μL·孔-1加入熒光素FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗（1∶200），37℃孵育 1 h后，PBS洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀(guān)察。

2.2.3 5’UTR PCR 鑒定

2.2.3.1 樣本RNA的提取和轉(zhuǎn)錄

使用Trizol提取法提取出樣本RNA，之后進(jìn)行cDNA轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增程序：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃5 min，4℃冷卻后取出，將cDNA放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3.2 5’UTR的PCR擴(kuò)增

（1）將合成的cDNA作為模板，在PCR管中加入試劑，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 8.5 μL，Quick Taq，12.5μL，5’UTR上游引物1μL，5’UTR下游引物1μL。

（2）按反應(yīng)體系加入試劑后，放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。程序如下：預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30 s，退火 56 ℃，30 s，延伸 72 ℃，45 s，35個(gè)循環(huán)，延伸72℃，10 min；4℃保存。

將膠板放入電泳儀中，取25μL PCR產(chǎn)物，加樣，設(shè)置400 V 200 A開(kāi)始電泳。電泳液為1×TAE緩沖液。在紫外燈下觀(guān)察PCR結(jié)果，拍照留圖并進(jìn)行膠回收實(shí)驗(yàn)。

2.2.3.3 PCR產(chǎn)物純化回收

按照OMEGA膠回收試劑盒使用說(shuō)明對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。

2.2.3.4 目的片段的測(cè)序

將膠回收產(chǎn)物進(jìn)行PCR鑒定后，進(jìn)行測(cè)序。

2.2.3.5 測(cè)序結(jié)果的拼接及篩選

使用MEGA X64軟件中對(duì)Genbank下載的相關(guān)已知病毒基因序列進(jìn)行整理，再用MEGA X64軟件中的Clustal W程序進(jìn)行序列比對(duì)，將序列前后多余部分刪除，使所需對(duì)比序列保持整齊。從NCBI上下載5’UTR Genbank號(hào)，保存所需數(shù)據(jù)，詳細(xì)見(jiàn)表1。

表1 5’UTR和E2參考毒株信息表Table 1 5’UTR and E2 reference strain information table

續(xù)表1 5’UTR和E2參考毒株信息表Continued table 1 5’UTR and E2 reference strain information table

2.2.4 BVDVE2基因鑒定

2.2.4.1 BVDVE2基因PCR擴(kuò)增

（1）將合成的cDNA作為模板，在PCR管中加入試劑，具體如下：cDNA模板，2 μL；ddH2O，8.5 μL；Quick Taq，12.5 μL；E2上/下游引物各 1 μL。

（2）按以上擴(kuò)增體系加完試劑后，放入儀器中進(jìn)行擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系如下預(yù)變性94℃，5 min；變性95 ℃，30 s；退火 59 ℃，45 s；延伸 72 ℃，90 s；共35個(gè)循環(huán)；延伸72℃，10 min；保存4℃。

2.2.4.2 PCR產(chǎn)物純化回收

按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化回收。

2.2.4.3 目的片段的測(cè)序

將膠回收產(chǎn)物進(jìn)行PCR鑒定后，進(jìn)行測(cè)序。

2.2.4.4 測(cè)序結(jié)果的拼接及篩選

使用MEGA X64軟件對(duì)Genbank下載的相關(guān)基因序列進(jìn)行整理，再用MEGA X64中的Clustal W程序進(jìn)行序列比對(duì)，截取序列保持整齊。從NCBI上下載E2基因的Genbank號(hào)，保存所需數(shù)據(jù)，詳細(xì)見(jiàn)表1。

2.2.5 BVDV 5’UTR同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

我們對(duì)使用5’UTR引物檢測(cè)出片段在300 bp左右的樣本的測(cè)序結(jié)果，使用BLAST將所得序列與Genbank中公布的BVDV基因序列進(jìn)行對(duì)比，確定樣本的基因型，使用DNAStar中Meglign軟件對(duì)序列的同源性進(jìn)行比對(duì)，使用Mega X64軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2.2.6 BVDVE2基因序列分析

2.2.6.1 BVDVE2基因的遺傳進(jìn)化分析

使用DNAstar軟件中Megalign程序，Clustal W法對(duì)實(shí)驗(yàn)中得到的E2基因序列進(jìn)行核苷酸水平以及推導(dǎo)氨基酸序列水平上進(jìn)行同源性分析。使用MEGA X64生物信息學(xué)分析軟件對(duì)E2基因擴(kuò)增序列和Genbank中的參考序列進(jìn)行了進(jìn)化樹(shù)分析，使用了常見(jiàn)方法鄰近法（NJ法）進(jìn)行比對(duì)。

2.2.6.2 BVDVE2基因理化性質(zhì)分析

使用在線(xiàn)分析軟件 https：//web.expasy.org/protscale/對(duì)實(shí)驗(yàn)中推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行疏水性、柔性以及跨膜趨勢(shì)進(jìn)分析。

2.2.6.3 BVDVE2基因抗原表位分析

使用Protean軟件中Jameson Wolf方法對(duì)實(shí)驗(yàn)中樣本序列和參考序列所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)分析。

3 結(jié)果

3.1 病毒分離鑒定結(jié)果

3.1.1 CPE觀(guān)察結(jié)果

經(jīng)過(guò)盲傳3代后觀(guān)察，24 h內(nèi)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生病變，在120 h時(shí)在20倍光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，細(xì)胞瓶?jī)?nèi)出現(xiàn)死亡細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)空泡和拉絲的現(xiàn)象，判斷陽(yáng)性的樣本生物型為致細(xì)胞病變型（CP型）[10]。

3.1.2 間接免疫熒光鑒定結(jié)果

采用單抗對(duì)分離株AD-1進(jìn)行IFA檢測(cè)，可以觀(guān)察到病毒在MDBK細(xì)胞中出現(xiàn)的熒光，對(duì)比組的MDBK細(xì)胞均未出現(xiàn)熒光。

3.1.3 5’UTR鑒定結(jié)果

以 BVDV 5’UTR 特異性引物（BVDV 324/326）擴(kuò)增出的目的片段，片段大小約為300 bp，與預(yù)期的目的片段大小相符。確定所提取RNA為BVDV。（圖1）

圖1 5’UTR PCR結(jié)果Fig.1 5’UTR PCR results

3.1.4 BVDV 5’UTR同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

圖2 BVDV 5’UTR基因核苷酸同源性結(jié)果Fig.2 BVDV 5’UTR nucleotide homology results

通過(guò)在BLAST對(duì)比結(jié)果顯示，樣本株AD-1基因型為BVDV-1d。將所得序列使用MegaX64與Genbank中公布的36株BVDV基因序列進(jìn)行核苷酸、氨基酸同源性比較，結(jié)果顯示，5’-UTR測(cè)序結(jié)果的AD-1與所有參考毒株的同源性為70.8%～99.5%。與BVDV-1型的同源性為75.4%～99.5%，與BVDV-2型的參考株同源性為76.4%～77.9%，與BVDV-3型的參考株同源性為70.8%。樣本株AD-1的同源性最高同為北京株 BJ1023（Genbank：KF925509）同源性為 99.5%，其次是玉樹(shù)株 Yushu2121（Genbank：KC414613）同源性為95.9%、寧夏株11Y59（Genbank：JX437158）同源性為94.9%。從進(jìn)化樹(shù)上可以看出，與北京株BJ1023處于同一進(jìn)化分支。（圖2、圖3）

圖3 BVDV 5’UTR基因核苷酸樹(shù)狀分析結(jié)果Fig.3 Nucleotide tree analysis of BVDV 5’UTR gene

3.2 BVDV E2基因分離鑒定

3.2.1E2基因PCR鑒定結(jié)果

以BVDVE2基因特異性引物（E2F/E2R）擴(kuò)增出目的片段，片段大小約為1 400 bp，與預(yù)期的目的片段大小相符。確定所提取RNA為BVDV。（圖4）

3.2.2 BVDVE2同源性分析結(jié)果

通過(guò)樣本株AD-1E2基因序列與參考序列的比對(duì)可知，與BVDV-1的同源性為72.5%～97.3%，與BVDV-2的同源性為64.2%，與BVDV-3的同源性為61.8%。樣品株AD-1與參考毒株中國(guó)北京株BJ1308（Genbank：KT951841）同源性最高為 97.3%，與其余1d兩株參考毒株，中國(guó)蘭州株ISO122（Genbank：KF048844） 和 韓 國(guó) 株 10JJ-SKR（Genbank：KC157383）的同源性均為97.1%。從進(jìn)化樹(shù)上可以看出，與北京株 BJ1308（Genbank：KT951841）同屬一組，親緣性較近（圖5、圖6）。

圖4 E2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 E2 PCR results

圖5 BVDV E2基因同源性分析結(jié)果Fig.5 BVDV E2 homology analysis results

圖6 BVDV E2基因核苷酸樹(shù)狀分析結(jié)果Fig.6 Nucleotide tree analysis of BVDV E2 gen

3.2.3 BVDVE2基因推導(dǎo)氨基酸的理化性質(zhì)分析

親水/疏水性是黃病毒科病毒E2基因的一個(gè)重要特性[13]。對(duì)毒株AD-1的E2基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行理化分析，從結(jié)果可知，E2親水性與疏水性為整齊的間隔分布，親水性與疏水性相鄰排列。20～50、310～330為較大的疏水區(qū)，110～130、350～370這兩個(gè)區(qū)段親水性最大，總親水性為-0.186，說(shuō)明親水性不強(qiáng)，不穩(wěn)定性為33.62，該蛋白質(zhì)可以分類(lèi)為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。BVDV的含有很多帶電荷的氨基酸殘基，在病毒二聚體的形成中起著重要的作用[14]。此次分析中我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)潛在的跨膜信號(hào)區(qū)域：30～50和410～420。負(fù)電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）：44個(gè)，帶正電殘基總數(shù)（Arg+Lys）：47 個(gè)。（圖 7、圖 8、圖 9）

圖7 分離株AD-1推導(dǎo)的氨基酸跨膜性分析Fig.7 Analysis of amino acid transmembrane deduced from isolate AD-1

圖8 分離株AD-1推導(dǎo)的氨基酸柔性分析Fig.8 Amino acid flexibility analysis derived from isolate AD-1

圖9 分離株AD-1推導(dǎo)的氨基酸疏水性分析Fig.9 Amino acid hydrophobicity analysis derived from isolate AD-1

3.2.4 BVDVE2基因抗原表位分析

利用DNAStar軟件中的Protean分析軟件，對(duì)病毒株AD-1的E2核苷酸序列所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)分析，并與其他參考株的氨基酸序列（其他參考株包括 BVDV-1、BVDV-2、BVDV-3）進(jìn)行比對(duì)，來(lái)分析比較樣本株和各毒株之間的差異。在分析結(jié)果中可知AD-1的E2基因的抗原表位與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株 BVDV-1 NADL和 BVDV-2 890、BVDV-3 LVRI/cont-1的抗原表位存在一定差異。與瑞士毒株SuwaCp（Genbank：KC853441）的抗原表位部分優(yōu)勢(shì)走勢(shì)一致[15]。（圖 10）

圖10 AD-1株與參考株E2基因抗原表位優(yōu)勢(shì)分析Fig.10 Epitope dominance analysis of E2 protein between AD-1 strain and reference strain

4 討論

引起牛的癥狀比較復(fù)雜具有多樣性，表現(xiàn)為持續(xù)感染（PI）、黏膜病、急性感染和繁殖障礙、免疫抑制[20]。將其概括為消化道型、呼吸道型、隱性感染和敗血型。收集到的病料為肺部組織，生物型為致細(xì)胞病變型。通過(guò)IFA試驗(yàn)，使用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行熒光可以間接檢測(cè)到病毒存在，進(jìn)一步證明該毒株為BVDV陽(yáng)性毒株。

對(duì)AD-1的5’UTR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將得到的序列進(jìn)行同源性分析和進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示，分離株AD-1的基因型為BVDV-1d型，與2018年北京株BJ1023（Genbank：KF925509）核苷酸同源性最高為99.5%，有著較近的進(jìn)化距離，親緣性最高。選取的5’UTR參考序列主要為中國(guó)地區(qū)已發(fā)表序列，國(guó)外序列作為補(bǔ)充。同時(shí)，擴(kuò)增E2基因進(jìn)行測(cè)序分析，根據(jù)分離株E2基因的同源性分析顯示，樣品株AD-1與參考毒株中國(guó)北京株 BJ1308（Genbank：KT951841）同源性最高為97.3%，進(jìn)化樹(shù)顯示二者在參考序列中親緣性最近，5’UTR與E2基因結(jié)果一致，均與BVDV-1d的同源性最高，所以進(jìn)一步佐證毒株AD-1為BVDV-1d型。2014年郎一飛[9]在血清及細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出了9種BVDV基因亞型，分別為1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p、1q 及 2a，基本上涵蓋了國(guó)內(nèi)流行的基因亞型。

傳統(tǒng)的生物學(xué)認(rèn)為，蛋白質(zhì)的序列決定了它的三維結(jié)構(gòu)，也就決定了它的功能[16]。因此我們對(duì)E2基因序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，了解其親/疏水性、柔性和是否存在跨膜，便于我們進(jìn)一步了解E2基因的結(jié)構(gòu)和功能。

目前，隨著對(duì)BVDV基因組結(jié)構(gòu)及功能的深入研究，有關(guān) BVDV 基因分型、E2、NS2、NS3、Npro 等蛋白生物學(xué)功能以及BVDV影響宿主細(xì)胞基因表達(dá)機(jī)制的研究，都取得了一定程度的進(jìn)展，為世界病毒學(xué)進(jìn)一步研究BVDV的致病機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)[12]。E2基因作為BVDV的主要保護(hù)性抗原蛋白，能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，且E2基因序列與其他蛋白相比也較為保守，因此有關(guān)BVDV的疫苗研究也主要以E2基因?yàn)楹诵膩?lái)展開(kāi)的[13-14]。瘟病毒科的主要抗原E2，其N(xiāo)端含有較多的種間共同抗原表位和種內(nèi)特異抗原表位，通過(guò)對(duì)抗原表位分析圖可以看到，BVDV-1和BVDV-2在抗原表位上差異性很大，而同一亞型的病毒在抗原表位的差別也不盡相同，說(shuō)明在氨基酸排列上的差異很可能是造成不同分型的原因之一。

研究通過(guò)對(duì)爆發(fā)牛呼吸道型綜合癥的牧場(chǎng)采集到的樣本，進(jìn)行分子生物學(xué)方法檢測(cè)，提取出了一株BVDV-1d毒株，可以為黑龍江地區(qū)BVDV毒株庫(kù)的構(gòu)建提供理論支持和參考依據(jù)。隨著南方養(yǎng)殖業(yè)北移，黑龍江省近年來(lái)牛只流動(dòng)量較大，這也意味著在黑龍江省沒(méi)有檢測(cè)出的基因型也許會(huì)因此途徑進(jìn)入，這對(duì)我們防控產(chǎn)生了更大的困難，而黑龍江省原有的主要流行毒株是否會(huì)因此發(fā)生改變還是未可知的，所以有必要對(duì)BVDV進(jìn)行追蹤了解，為進(jìn)一步的防控提供數(shù)據(jù)支持。