miR-551b在甲狀腺癌中的表達(dá)及對(duì)SW579細(xì)胞增殖和凋亡的影響

措 羊,張雙元

(1青海省交通醫(yī)院普外科,西寧 810000;2青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科)

甲狀腺癌是一種內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,惡性程度較低,在女性中發(fā)病率較高,流行病學(xué)研究顯示,近30年來,其發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)[1]。甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確,但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,其病因、發(fā)生發(fā)展等方面的研究也在不斷深入[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是在線蟲研究中發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的非編碼小RNA分子,主要通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄水平在生理、病理過程中發(fā)揮調(diào)控作用,是最近腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3,4]。有研究證實(shí),多個(gè)miRNA在甲狀腺癌中表達(dá)異常,與甲狀腺癌臨床特征密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn),miR-551b在胃癌組織中表達(dá)下降,能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲等細(xì)胞生物學(xué)功能,發(fā)揮類似抑癌基因的作用[6,7]。但miR-551b在甲狀腺癌中的作用尚不清楚。本研究旨在探討miR-551b在甲狀腺癌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響,以期為尋找甲狀腺癌治療的新靶點(diǎn)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人甲狀腺癌細(xì)胞SW579(貨號(hào):HZ-CC100702)購自美國ATCC細(xì)胞庫;胎牛血清(貨號(hào):FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司;DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào):KL-P0032)購自德國merck/sigma公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(貨號(hào):11668019)購自美國Invitrogen公司;CCK-8試劑(貨號(hào):CK-04)購自日本同仁化學(xué)研究所;Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):S0185)購自哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司;miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):QP013/QP014)購自美國GeneCopoeia;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào):K1002S)購自美國Promega公司;nonsense siRNA、miR-551b siRNA、negative control-miR-551b、hsa-miR-551b mimic序列和miR-551b、U6引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)抗體、GAPDH抗體(貨號(hào):ab18197、ab53154、ab226977、ab181602)購自Abcam公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號(hào):0295G-HRP)購自美國Santa公司;恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào):MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司;熒光定量PCR儀(型號(hào):ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司;流式細(xì)胞儀(型號(hào):BD FACSCanto Ⅱ)購自美國BD公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):MODEL550)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào):ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測(cè)miR-551b在甲狀腺癌中的表達(dá)情況 收集2017年10月至2019年10月本院獲得的28例甲狀腺癌組織及其癌旁正常組織標(biāo)本,均經(jīng)病理診斷確診,標(biāo)本獲取均獲得患者知情同意,且均于化放療等治療前經(jīng)手術(shù)切除獲得,保存于液氮中。所有手術(shù)標(biāo)本的采集均取得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

使用TRIzol試劑提取組織中總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,參照qRT-PCR試劑盒說明配制反應(yīng)體系,在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,以2-ΔΔCt法表示miR-551b表達(dá)水平,Ct值為擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到臨界閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù),內(nèi)參基因?yàn)閁6。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性10 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)40次。miR-551b逆轉(zhuǎn)錄頸環(huán)引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTGAAA-3′。miR-551b上游引物:5′-CTGAGCGACCCATACTTGG-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;內(nèi)參U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.2 SW579細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將SW579細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)到80%左右,用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)期SW579細(xì)胞,以1×105個(gè)/ml、100 μl/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板,分為對(duì)照組、siRNA NC組、miR-551b siRNA組、mimic NC組和miR-551b mimic組,其中對(duì)照組SW579細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染,siRNA NC組、miR-551b siRNA組、mimic NC組和miR-551b mimic組SW579細(xì)胞使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染nonsense siRNA、miR-551b siRNA、negative control-miR-551b和hsa-miR-551b mimic,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,qRT-PCR法檢測(cè)各組SW579細(xì)胞中miR-551b表達(dá)情況。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)各組SW579細(xì)胞增殖情況 經(jīng)相應(yīng)處理后,將SW579細(xì)胞培養(yǎng)48 h,加入CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2 h,使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)時(shí)各孔的吸光度(optical density,OD)值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SW579細(xì)胞凋亡情況 經(jīng)相應(yīng)處理后,將SW579細(xì)胞培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,胰蛋白酶消化、PBS洗滌后,使用400 μl 1×結(jié)合緩沖液將SW579細(xì)胞調(diào)整成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液,按照Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒操作說明書步驟,加入Annexin Ⅴ-FITC、PI各5 μl,避光孵育1 h,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SW579細(xì)胞周期分布情況 經(jīng)相應(yīng)處理后,將SW579細(xì)胞培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,PBS洗滌,用-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定1 h,離心除去乙醇,PBS洗滌,用500 μl RNase/PI重懸細(xì)胞,避光染色20 min,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況,統(tǒng)計(jì)G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞的百分比。

1.2.6 蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)各組SW579細(xì)胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達(dá)情況 經(jīng)相應(yīng)處理后,將SW579細(xì)胞培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞,使用蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白,測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行定量。SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h,分別加入PCNA抗體(1 ∶500)、Bax抗體(1 ∶500)、Cyclin D1抗體(1 ∶500)、GAPDH抗體(1 ∶500),4 ℃孵育過夜,TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶1 000),室溫孵育1 h,ECL顯色,凝膠成像分析儀采集圖像并分析條帶灰度,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-551b在甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

miR-551b在甲狀腺癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)水平分別為0.73±0.09和1.02±0.14,甲狀腺癌組織中miR-551b表達(dá)水平較癌旁正常組織顯著降低(t=9.220,P<0.05)。

2.2 各組SW579細(xì)胞中miR-551b表達(dá)情況

對(duì)照組、siRNA NC組、mimic NC組間SW579細(xì)胞中miR-551b表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細(xì)胞中miR-551b表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細(xì)胞中miR-551b表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見表1)。

表1 各組SW579細(xì)胞中miR-551b表達(dá)水平比較

2.3 各組SW579細(xì)胞增殖情況

對(duì)照組、siRNA NC組、mimic NC組間SW579細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細(xì)胞OD值顯著升高(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細(xì)胞OD值顯著降低(P<0.05,見表2)。

表2 各組SW579細(xì)胞OD值比較

2.4 各組SW579細(xì)胞凋亡情況

對(duì)照組、siRNA NC組、mimic NC組間SW579細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05,見表3、圖1)。

表3 各組SW579細(xì)胞凋亡率比較

圖1 各組SW579細(xì)胞凋亡情況Figure 1 Apoptosis in each SW579 cells groups

2.5 各組SW579細(xì)胞周期分布情況

對(duì)照組、siRNA NC組、mimic NC組間G0/G1期、S期、G2/M期SW579細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組G0/G1期SW579細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05),S期、G2/M期SW579細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組G0/G1期SW579細(xì)胞比例顯著升高(P<0.05),S期、G2/M期SW579細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05,見圖2、表4)。

圖2 各組SW579細(xì)胞周期分布情況Figure 2 Cell cycle distribution of SW579 cells in each group

表4 各組SW579細(xì)胞周期分布情況比較

2.6 各組SW579細(xì)胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達(dá)情況

對(duì)照組、siRNA NC組、mimic NC組間SW579細(xì)胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05,見圖3、表5)。

圖3 各組SW579細(xì)胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達(dá)情況Figure 3 Expression of PCNA,Bax, Cyclin D1 proteins in SW579 cells in each group

表5 各組SW579細(xì)胞中PCNA、Bax、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

miRNA是由20-22個(gè)核苷酸組成的、不編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA,廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi),通過與靶基因mRNA的3′UTR互補(bǔ)匹配,影響靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、分化等一系列重要的生理過程[8]。雖然miRNA分子小、數(shù)量少,但能調(diào)控大量基因的表達(dá),在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[9]。在甲狀腺癌研究中,已有大量miRNA被發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌中異常表達(dá),參與甲狀腺癌增殖、凋亡、遷移、侵襲等過程[10,11]。

miR-551b作為一種miRNA,有研究發(fā)現(xiàn)其與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。溫馨等[13]研究表明,miR-551b-3p在胃癌組織中低表達(dá),并且能夠抑制胃癌細(xì)胞系HGC-27的增殖、遷移和侵襲。王婭南等[7]研究表明,miR-551b能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲等細(xì)胞生物學(xué)功能。除了胃癌,郭欣等[14]在胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn),miR-551b-3p在4種胰腺癌細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量均低于正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞,其在胰腺癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織,且其表達(dá)與胰腺癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期相關(guān)。然而,miR-551b在不同腫瘤中發(fā)揮的作用亦不同,在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用,在其他癌癥中可能發(fā)揮促癌基因作用[15]。Wei等[16]研究表明,miR-551b可能通過抑制Foxo3和TRIM31這兩個(gè)重要的腫瘤抑制因子,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞、卵巢癌干細(xì)胞的增殖、侵襲及化學(xué)耐藥性。Chaluvally-Raghavan等[17]研究表明,miR-551b-3p表達(dá)增加與高級(jí)別漿液性上皮性卵巢癌的預(yù)后惡化有關(guān),其在體外和體內(nèi)均有助于抵抗癌細(xì)胞的凋亡,增加癌細(xì)胞的存活和增殖,沉默其表達(dá)可抑制裸鼠卵巢癌腫瘤的生長(zhǎng)。

本研究檢測(cè)miR-551b在甲狀腺癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)發(fā)現(xiàn),miR-551b在甲狀腺癌組織較癌旁正常組織中表達(dá)顯著降低。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細(xì)胞OD值顯著升高,miR-551b表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯著降低;與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細(xì)胞OD值顯著降低,miR-551b表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率顯著升高,這表明miR-551b在甲狀腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用,可以抑制SW579細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組G0/G1期SW579細(xì)胞比例顯著降低,S期、G2/M期SW579細(xì)胞比例顯著升高;與mimic NC組相比,miR-551b mimic組G0/G1期SW579細(xì)胞比例顯著升高,S期、G2/M期SW579細(xì)胞比例顯著降低,提示miR-551b可能通過抑制SW579細(xì)胞向S期、G2/M期進(jìn)展,并將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,從而發(fā)揮抑制SW579細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。PCNA是增殖相關(guān)基因,在甲狀腺癌增殖過程中發(fā)揮作用[18]。Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員,參與調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞凋亡[19]。Cyclin D1參與細(xì)胞周期進(jìn)展,進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、凋亡過程[20]。本研究結(jié)果顯示,與siRNA NC組相比,miR-551b siRNA組SW579細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1蛋白水平顯著升高,Bax蛋白水平顯著降低;與mimic NC組相比,miR-551b mimic組SW579細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1蛋白水平顯著降低,Bax蛋白水平顯著升高,提示miR-551b可能通過影響PCNA、Bax、Cyclin D1等表達(dá)參與對(duì)SW579細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展的調(diào)控。

綜上所述,miR-551b在甲狀腺癌組織中表達(dá)下調(diào),可能通過將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,抑制SW579細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,有望成為甲狀腺癌治療的新靶點(diǎn)。