lncRNA RP11-374M1.2通過上調(diào)LKB1基因表達抑制前列腺癌細胞的侵襲和增殖

唐 迪,左其明,張 佼,李 鋒,彭善君,王田輝

(1重慶市梁平區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科,重慶 405200;2重慶市奉節(jié)縣人民醫(yī)院泌尿外科;*通訊作者,E-mail:wangtianhuifengjie@163.com)

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,嚴重威脅男性居民健康[1]。前列腺癌的發(fā)病率逐年增加,呈年輕化趨勢,前列腺癌細胞的惡性生物學行為造成部分前列腺癌患者的生存率很低[2]。深入研究前列腺癌細胞侵襲和增殖的作用機制,對了解前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及確定新的分子治療靶點具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)長度大于200個核苷酸,主要定位于細胞質(zhì)和細胞核,屬于非編碼RNA,在細胞發(fā)育、新陳代謝等各項生命活動中發(fā)揮重要調(diào)控作用[3]。越來越多的研究表明,lncRNA可在表觀遺傳學水平影響腫瘤細胞的基因表達,參與調(diào)控腫瘤細胞的惡性生物學行為[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),lncRNA在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用[5]。研究前列腺癌相關lncRNA,有望明確前列腺癌細胞惡性生物學行為的病理、生理機制。RP11-374M1.2是一個尚未被報道研究的lncRNA,長度為1 407 nt。本研究檢測了37例前列腺癌手術患者的腫瘤組織和對應癌旁組織中RP11-374M1.2的表達,通過在前列腺癌DU-145細胞中過表達RP11-374M1.2,觀察RP11-374M1.2對前列腺癌細胞惡性生物學行為的影響,并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本來源

收集重慶市梁平區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科自2017年5月至2019年3月手術切除的組織標本37例,液氮中保存。所有前列腺癌組織和癌旁組織均經(jīng)術后病理證實,前列腺癌組織學類型均為腺癌。所有患者術前均未接受放射治療、化學治療和抗雄激素藥物治療。本研究經(jīng)重慶市梁平區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞株和主要試劑

DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司;前列腺癌細胞株DU-145購于上海信然生物技術有限公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購于美國Sigma公司;陰性對照慢病毒、攜帶RP11-374M1.2的慢病毒購于南京諾唯贊生物科技有限公司;胎牛血清購于美國Gibco公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司;Transwell小室購于美國Corning公司;一抗ZEB-1、LKB1、GAPDH、CDK4、Snail及Cyclin D2購于美國Abcam公司;基質(zhì)膠購于美國Life Technologies公司;超敏ECL發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和感染

前列腺癌細胞株DU-145采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),于37 ℃、體積分數(shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將活力良好的對數(shù)生長期DU-145細胞種板,細胞匯合度為60%時感染慢病毒。設置感染復數(shù)為30,實驗步驟嚴格按照說明書操作,分別感染攜帶RP11-374M1.2的慢病毒和陰性對照慢病毒,定義為實驗組和對照組。慢病毒感染12 h后,更換新鮮培養(yǎng)基。

1.4 qPCR檢測RP11-374M1.2和LKB1 mRNA的表達量

取150 mg組織或相應各組細胞,根據(jù)說明書采用Trizol試劑提取總RNA,紫外分光儀檢測RNA濃度和純度后,逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。qPCR法檢測RP11-374M1.2和LKB1 mRNA的相對表達。以GAPDH作內(nèi)參,計算RP11-374M1.2和LKB1的表達量,所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法計算。引物序列見表1。qPCR反應條件:95 ℃預變性60 s,95 ℃變性15 s,62 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共35個循環(huán)。

表1 qPCR引物序列

1.5 Transwell侵襲實驗檢測感染DU-145細胞的侵襲能力

將基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell上室,凝固1 h。收集感染后48 h的DU-145細胞,應用無血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為4×105個/ml。加入200 μl細胞懸液至上室,加入700 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至下室。24 h后,采用多聚甲醛固定20 min,采用結(jié)晶紫染液染色20 min,采用流水沖洗殘余染液,采用棉簽輕輕擦去未穿膜細胞。室溫晾干,高倍顯微鏡下統(tǒng)計每組穿過底膜的細胞數(shù),表示DU-145細胞的侵襲能力。

1.6 四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測感染DU-145細胞的增殖能力

收集感染后48 h的DU-145細胞,應用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度,以每孔3 000個接種于96孔板,每組4個復孔。分別于接種細胞后的第1-5天行MTT檢測,每孔加入18 μl MTT試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,每孔加入180 μl二甲基亞砜,振蕩溶解結(jié)晶。采用酶標儀檢測每孔在波長495 nm處的吸光度(A)值。

1.7 Western blot檢測靶基因的表達

收集感染后48 h的DU-145細胞,采用蛋白提取緩沖液提取細胞總蛋白。每組的蛋白上樣量均為60 μg。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,采用PVDF膜轉(zhuǎn)膜,采用5%脫脂牛奶在室溫下封閉PVDF膜。分別孵育LKB1(稀釋比為1 ∶1 000)、CDK4(稀釋比為1 ∶3 000)、Cyclin D2(稀釋比為1 ∶2 000)、Snail(稀釋比為1 ∶1 000)、ZEB-1(稀釋比為1 ∶1 000)和GAPDH一抗(稀釋比均為1 ∶2 000),在4 ℃搖床孵育過夜。洗膜后,在室溫下孵育二抗鼠抗(稀釋比為1 ∶10 000)。配制超敏ECL發(fā)光試劑,在凝膠成像儀中顯影、拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織中RP11-374M1.2的表達

qPCR結(jié)果顯示,37例前列腺癌組織和癌旁組織中RP11-374M1.2的相對表達量分別為0.84±0.23和5.71±1.43,癌旁組織RP11-374M1.2的相對表達量是前列腺癌組織的4.08倍,差異有統(tǒng)計學意義(t=23.93,P<0.01)。

2.2 DU-145細胞感染RP11-374M1.2病毒的效率

qPCR結(jié)果顯示,對照組和實驗組細胞中RP11-374M1.2的相對表達量分別為1.02±0.81和12.39±1.89,實驗組RP11-374M1.2的相對表達量是對照組的12.12倍,差異有統(tǒng)計學意義(t=5.97,P<0.01)。

2.3 RP11-374M1.2對DU-145細胞侵襲能力的影響

對照組和實驗組細胞中穿膜DU-145細胞數(shù)分別為(93.15±10.05)個和(24.50±7.82)個。與對照組比較,實驗組穿膜DU-145細胞數(shù)明顯較少,差異有統(tǒng)計學意義(t=5.19,P<0.01,見圖1),RP11-374M1.2具有抑制前列腺癌DU-145細胞侵襲的能力。

與對照組相比,**P<0.01圖1 RP11-374M1.2對DU-145細胞侵襲能力的影響Figure 1 Effect of RP11-374M1.2 on the invasion ability of DU-145 cells

2.4 RP11-374M1.2對DU-145細胞增殖能力的影響

MTT法結(jié)果顯示,實驗組DU-145細胞在感染后第3,4,5天的A值低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),表明RP11-374M1.2具有抑制前列腺癌DU-145細胞增殖的能力。在第1,2天的A值差異無統(tǒng)計學意義(t=0.18,P>0.05;t=2.19,P>0.05,見圖2)。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 RP11-374M1.2對DU-145細胞增殖能力的影響Figure 2 Effect of RP11-374M1.2 on the proliferation of DU-145 cells

2.5 DU-145細胞感染RP11-374M1.2慢病毒對LKB1 mRNA表達的影響

qPCR結(jié)果顯示,感染RP11-374M1.2慢病毒后的實驗組DU-145細胞中LKB1 mRNA的相對表達量明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(7.37±2.14vs1.06±0.05,t=12.52,P<0.01,見圖3),表明RP11-374M1.2可有效促進LKB1 mRNA的相對表達。

與對照組比較,**P<0.01圖3 RP11-374M1.2對LKB1 mRNA表達的影響Figure 3 Effect of RP11-374M1.2 on the expresstion of LKB1 mRNA

2.6 LKB1蛋白的表達水平

Western blot結(jié)果表明,感染RP11-374M1.2慢病毒后的實驗組DU-145細胞中,LKB1蛋白表達量明顯升高,細胞侵襲相關蛋白Snail蛋白和ZEB-1蛋白表達明顯減少,細胞增殖相關蛋白Cyclin D2蛋白和CDK4蛋白表達減少(見圖4)。

圖4 RP11-374M1.2對LKB1蛋白及相關蛋白表達的影響Figure 4 Effect of RP11-374M1.2 on the expression of LKB1 protein and related proteins

3 討論

長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA,lncRNA)是繼微小RNA后,非編碼RNA領域的又一熱點[6]。由于lncRNA不具備翻譯蛋白的功能,起初被人們認為是“轉(zhuǎn)錄噪音”,不影響細胞的生命活動[7]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),lncRNA可在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等多水平影響基因的表達,具有明顯的生物學功能[8]。隨著研究深入,大量lncRNA被證實在包括前列腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤中異常表達,在腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)化、進展等過程起重要作用[9]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA MYU在前列腺癌組織中明顯上調(diào),可促進前列腺癌細胞的增殖和遷移,lncRNA MYU主要通過miR-184/c-Myc分子軸發(fā)揮作用,在前列腺癌中起著類似癌基因的作用。Zhao等[11]發(fā)現(xiàn)lncRNA ANRIL在前列腺癌組織和細胞株中高表達,其主要通過調(diào)節(jié)let-7a/TGF-β1/Smad信號通路,促進前列腺癌細胞的增殖和遷移。Huang等[12]發(fā)現(xiàn)lncRNA TMPO-AS1與前列腺癌的進展和患者的不良預后密切相關,通過影響細胞周期促進細胞的增殖,并對前列腺癌細胞的遷移具有正向調(diào)控作用。lncRNA對于發(fā)現(xiàn)新的前列腺癌分子治療靶點具有重要意義。RP11-374M1.2是一種尚未被報道研究的lncRNA,其在前列腺癌組織中的表達和作用機制尚不清楚。

本研究以RP11-374M1.2作為研究對象,通過qPCR法驗證其在37例配對組織中的表達差異,結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,RP11-374M1.2在前列腺癌組織中的表達明顯降低,RP11-374M1.2可能具有抑制前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用。通過進一步研究RP11-374M1.2對前列腺癌侵襲和增殖的影響,將載有RP11-374M1.2的慢病毒感染前列腺癌DU-145細胞,通過Transwell侵襲實驗和MTT法檢測上調(diào)RP11-374M1.2后DU-145細胞的侵襲和增殖能力。結(jié)果顯示,上調(diào)RP11-374M1.2可明顯抑制前列腺癌DU-145細胞的侵襲能力和增殖能力,表明RP11-374M1.2可抑制前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移和生長。

肝激酶B1(LKB1)基因位于第19號染色體短臂13.3區(qū),由10個外顯子組成,可翻譯為433個氨基酸組成的細胞內(nèi)激酶[13]。LKB1幾乎表達于人體所有組織,負責調(diào)控細胞增殖、新陳代謝等各種生理活動[14]。近年的研究發(fā)現(xiàn),LKB1在多種惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌表達缺失或突變,導致細胞不可控性侵襲和增殖,參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[15]。研究發(fā)現(xiàn),LKB1在前列腺癌組織和細胞株中的表達明顯降低,在DU-145細胞株中的表達最低,與多西他賽的化療敏感性顯著相關[16,17]。上調(diào)LKB1可明顯抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,LKB1在前列腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用[18]。qPCR和Western blot顯示,上調(diào)RP11-374M1.2在mRNA和蛋白水平上均可明顯促進LKB1基因的表達。LKB1蛋白表達升高后,細胞侵襲相關蛋白Snail和ZEB-1蛋白表達明顯降低,細胞增殖相關蛋白Cyclin D2和CDK4蛋白表達明顯降低,表明細胞侵襲能力和增殖能力受到明顯抑制。RP11-374M1.2是通過降低LKB1基因的表達,參與抑制前列腺癌細胞的侵襲和增殖能力。

綜上所述,前列腺癌組織中RP11-374M1.2呈低表達,上調(diào)RP11-374M1.2明顯抑制前列腺癌細胞的侵襲和增殖能力,其作用機制可能通過上調(diào)LKB1基因的表達。RP11-374M1.2在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中起著類似抑癌基因的作用,有望在未來成為前列腺癌分子治療新的靶點。