NADPH氧化酶在油酸誘導的H9c2心肌細胞凋亡中的作用

何勇鵬，孫 迪，劉恩寵，何 杰，李 忌，王振華

(煙臺大學生命科學學院/線粒體與健康衰老研究中心，山東 煙臺 264005)

糖尿病心肌病是獨立于高血壓和冠心病等其他心血管病變之外的心臟病變[1],糖毒性、氧化應激、內質網應激、線粒體功能失常、脂毒性等都是其潛在發(fā)病機制，但其確切分子機制仍不清楚，現(xiàn)有研究表明氧化應激是導致心肌細胞凋亡的重要原因.

活性氧(ROS)來源于細胞呼吸代謝過程中的副產物, 參與多種生理生化和病理過程中的信號傳導[2-5].線粒體是病理性ROS合成的關鍵位點，NADPH氧化酶(NOXs)則是細胞內源性ROS產生的主要來源之一，與其他酶類生成ROS方式不同，而是通過將NADPH上的電子轉移到O2上產生ROS[6-9].NADPH氧化酶可作為細胞內關鍵信使分子，其激活可通過多種信號通路誘導細胞凋亡[10-12].

油酸(cleic acid,OA.結構式如圖1)是構成食用油脂中含量最高的單不飽和脂肪酸，亦是人體血漿中含量最高的游離脂肪酸之一[13].血漿油酸水平與胰島素抵抗相關，也是糖尿病發(fā)生的獨立危險因素[14].心血管事件是糖尿病患者致死的首要危險因素，2型糖尿病患者在未有明確血管受損時，亦有心臟功能受損表現(xiàn)，稱為糖尿病心肌病[15-16]. 本研究以油酸復制H9c2心肌細胞體外損傷模型，探究NADPH氧化酶在油酸誘導的心肌細胞損傷中的關鍵作用，為糖尿病心肌病的防治提供新的研究思路.

圖1 油酸結構式

1 材 料

1.1 實驗細胞系

H9c2(2-1)大鼠心肌細胞購自中國科學院上海細胞庫.

1.2 儀器與設備

細胞培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司); 生物超凈臺(蘇州凈化設備有限公司); 倒置相差顯微鏡(香港Motic公司); 多功能酶標儀(Molecular Devices Corporation); ACEA NovoCyte TM系列流式細胞儀(艾森生物科學公司); Micro 21R高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific Inc); 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市科興儀器廠); 電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司); MH-2 微孔板孵育振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司); 蛋白電泳儀器(美國BIO-RAD公司); Tanon5500凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司).

1.3 材料與試劑

油酸(美國 Sigma公司); MTT粉末(北京 Biodee公司); 蛋白酶抑制劑(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA); BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA); NAC、 mito-TEMPO、 DCFH-DA探針美國(美國Sigma公司); DPI(美國 Selleck 公司);β-actin一抗、Caspase 3(美國 CST 公司)、一抗、Bax一抗、Bcl-2一抗(上海 Abcam 公司); HRP 耦聯(lián)山羊抗兔 IgG(美國 Santa Cruz Biotechnology 公司).

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

H9c2心肌細胞培養(yǎng)于高糖DMEM培養(yǎng)基(含10% Gibco血清和雙抗)中，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至70%～80%融合時，用含0.25% EDTA胰酶消化細胞，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗.

2.2 油酸的配制

精密量取1 mL 0.1 μmol/L的NaOH并將其加熱至75 ℃，將31.4 μL 油酸加入至NaOH中，超聲震蕩至完全溶解后，制備油酸母液濃度為100 mmol/L.以10% BSA為溶劑將油酸稀釋至濃度分別為2、4、8 mmol/L，使用0.22 μm濾膜過濾后，于-20 ℃分裝保存.使用前，將不同濃度油酸于37 ℃溫水浴溶解，使用時，將油酸按不同濃度與DMEM完全培養(yǎng)基1∶9進行混合加入至BSA終濃度為1%.

2.3 細胞實驗分組

2.3.1 油酸干預實驗 將H9c2心肌細胞隨機分為對照組與實驗組(不同濃度、不同時間油酸處理).

2.3.2 抑制劑干預實驗 將H9c2心肌細胞隨機分為對照組、油酸組、抑制劑處理組、抑制劑與油酸聯(lián)用組(抑制劑提前30 min預處理).

2.4 細胞活力檢測

在96孔板中接種H9c2心肌細胞懸液(細胞2×104個·L-1，每孔100 μL)，每組設置6個復孔.在37 ℃、 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，按照實驗設計，加入不同濃度含油酸的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)不同時間.處理終點后，吸棄原培養(yǎng)液，加入100 μL含10% MTT(5 mg/mL)的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中孵育3 h.吸棄MTT培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO溶液，平板振蕩15 min，酶標儀測定570 nm吸光度，計算公式如下：細胞增殖活力=實驗組A(校正后) /對照組A(校正后)× 100 %

2.5 細胞內ROS檢測

在6孔板中接種H9c2心肌細胞懸液(細胞5×104個·L-1，每孔100 μL)，每組設置3個復孔.在37 ℃、 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，按照實驗設計，加入不同濃度含油酸的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng).實驗結束后，吸棄培養(yǎng)基，PBS清洗一遍，加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針，37 ℃孵育20 min.吸棄探針，用PBS清洗2遍，300 μL胰酶消化細胞1000 ×g，4 ℃離心6 min.吸棄上清，加入500 μL PBS重懸，放入冰盒避光，利用流式細胞儀定量ROS水平.

2.6 細胞凋亡檢測

在6孔板中接種H9c2心肌細胞懸液(細胞5×104個·L-1，每孔100 μL)，每組設置3個復孔.在37 ℃、 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，按照實驗設計，加入不同濃度含油酸的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng).處理終點時，將把細胞培養(yǎng)液吸出至合適離心管內，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入300 μL胰酶消化細胞，吸棄胰酶，用收集到的培養(yǎng)基將細胞輕輕吹打下來，轉移至離心管內，1000 ×g離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS 輕輕重懸細胞并計數(shù)并取1×104個細胞.依據情況加入相應的Annexin-FITC/PI/FITC結合液.室溫避光放置15 min，置于4 ℃利用流式細胞儀檢測凋亡情況.

2.7 細胞內蛋白表達檢測

細胞經過油酸處理終點后，用冷PBS洗滌樣品，并用含有蛋白酶抑制劑混合物的緩沖液裂解(RAPA∶PMSF=100∶1， PMSF母液濃度為100 μmol/L).將裂解物在4 ℃下以14 000 ×g離心15 min.用BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白質濃度.通過SDS-PAGE分離蛋白質提取物并電轉移到PVDF膜上.用TBS-T緩沖液中的5 %無脂牛奶封閉膜90 min，并在4 ℃下與一抗孵育過夜.用TBST洗滌后，將膜與二抗在室溫下溫育1 h.β-actin 用作內部對照.從3次實驗中顯示代表性印跡，并用增強的化學發(fā)光(ECL)試劑拍攝圖像.

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結 果

3.1 油酸刺激引起H9c2心肌細胞增殖抑制

通過前期實驗結果驗證配制油酸的溶劑本身無毒.不同濃度油酸刺激H9c2心肌細胞72 h后，所致心肌細胞增殖率呈現(xiàn)濃度依賴性降低趨勢(圖2(a))；400 μmol/L 油酸刺激H9c2心肌細胞24、48、72 h后，所致心肌細胞增殖率呈現(xiàn)時間依賴性下降趨勢(圖2(b))，表明油酸可引起H9c2細胞增殖抑制.

3.2 油酸刺激引起H9c2心肌細胞內ROS的產生

為探究油酸是否會引起H9c2心肌細胞內活性氧的產生，采用DCFH-DA熒光探針利用流式細胞儀檢測細胞內ROS的產生情況.與對照組相比，利用不同濃度的油酸刺激細胞后，可引起細胞內ROS升高并呈濃度依賴性(圖3(a))；利用400 μmol/L 的油酸刺激細胞不同時間后，可引起細胞內ROS升高并呈時間依賴性(圖3(b));表明油酸可引起H9c2心肌細胞內ROS的產生.

3.3 NADPH氧化酶抑制劑降低油酸引起H9c2心肌細胞內ROS的產生

為確定油酸刺激細胞后引起ROS產生的來源，利用總活性氧抑制劑NAC、線粒體源活性氧抑制劑 mito-TEMPO 以及NADPH氧化酶抑制劑DPI與油酸聯(lián)用，72 h后檢測細胞ROS的產生情況. 結果表明(圖4),1 mmol/L NAC與10 μmol/L DPI預處理0.5 h均可顯著性降低油酸引起的ROS增加，而10 μmol/L mito-TEMPO 則不能降低油酸引起的ROS增加,說明油酸引起的H9c2細胞內ROS的產生來源于NADPH氧化酶.

與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01.

與正常組相比，*P < 0.05，**P < 0.01.

與正常組相比，**P < 0.01；與油酸組相比，##P<0.01， NS>0.05.

3.4 NADPH氧化酶抑制劑降低油酸引起H9c2心肌細胞增殖抑制

探究NADPH氧化酶抑制劑DPI是否可逆轉油酸刺激后的細胞命運，對DPI作用細胞后細胞形態(tài)學進行觀察與細胞活力的測定.結果表明：10 μmol/L DPI 與油酸聯(lián)用后，可明顯改善細胞狀態(tài)(圖5)，通過MTT結果發(fā)現(xiàn)聯(lián)用后可顯著降低油酸引起的細胞增殖抑制(圖6)，提示NADPH氧化酶合成的ROS參與油酸誘導的H9c2心肌細胞增殖抑制.

圖5 DPI對油酸致H9c2心肌細胞形態(tài)學變化的影響

與正常組相比， **P < 0.01；與油酸組相比，#P < 0.05， NS > 0.05.

3.5 NADPH氧化酶抑制劑抑制油酸引起H9c2心肌細胞凋亡

3.5.1 Western blot 法檢測細胞凋亡 Bcl-2 家族成員與Caspase 3剪切在細胞凋亡過程中起到至關重要的作用.為確定油酸引起H9c2心肌細胞的死亡機制，利用western blot 法檢測Caspase 3 剪切、Bax、Bcl-2蛋白變化.結果表明：與對照組相比，油酸可明顯增加Caspase 3 剪切水平(圖7)，同時降低了Bcl-2/Bax蛋白表達水平(圖8)，提示油酸可誘導H9c2心肌細胞凋亡；采用DPI預處理0.5 h后可明顯降低油酸誘導的Caspase 3 剪切水平，并且增加了Bcl-2/Bax蛋白表達變化.

與正常組相比， **P < 0.01；與油酸組相比，##P < 0.01.

與正常組相比， **P < 0.01；與油酸組相比，#P < 0.05.

3.5.2 流式細胞術檢測細胞凋亡 利用早期凋亡細胞中出現(xiàn)磷脂酰絲氨酸外翻的原理進行凋亡的檢測，利用Annexin V / PI雙染后流式細胞術測定凋亡時相來檢測細胞凋亡程度.結果表明：與對照組相比，油酸可引起凋亡數(shù)量明顯增加，采用DPI預處理0.5 h后可明顯降低油酸誘導心肌細胞凋亡數(shù)量(圖9、圖10)，提示NADPH氧化酶所產生的ROS參與油酸誘導的H9c2心肌細胞凋亡.

4 討 論

脂毒性作為一種危險因素，可對心肌細胞造成不可逆的損傷，同時導致心肌細胞結構與功能均發(fā)生改變，增加細胞凋亡.已有研究表明棕櫚酸可對H9c2心肌細胞造成脂毒性，并且能夠誘導細胞凋亡[17-18],而不飽和脂肪酸對心肌是否有毒性作用卻未見報道.本研究利用油酸進行心肌脂毒性的機制探討，為糖尿病心肌病的防治提供新的思路.

圖9 DPI對油酸致H9c2心肌細胞凋亡的影響(3次獨立重復實驗中代表性圖片)

與正常組相比，**P < 0.01；與油酸組相比，##P < 0.01.

研究表明，由氧化脅迫導致的心肌細胞凋亡是糖尿病患者非缺血性心力衰竭發(fā)生的重要原因[19].糖尿病心血管系統(tǒng)中有多種ROS來源，其中包括線粒體電子傳遞鏈，NADPH氧化酶和其他酶類.糖尿病發(fā)病過程中，糖脂代謝紊亂是引起心肌功能障礙的重要原因.已有研究表明，NADPH氧化酶在高糖誘導的心肌細胞損傷中發(fā)揮重要的作用，同時也參與由高脂誘導的MIN6胰島β細胞凋亡[20-21]，而NADPH氧化酶在高脂誘導的心肌細胞損傷中的作用也未見報道.本研究利用油酸刺激H9c2心肌細胞，在非靶向抗氧化劑NAC、線粒體靶向抗氧化劑mito-TEMPO以及NADPH氧化酶抑制劑DPI聯(lián)合油酸的作用下，證實了油酸致細胞氧化脅迫的源頭為NADPH氧化酶，表明了NADPH氧化酶來源的ROS介導了油酸的細胞毒活性.

細胞凋亡作為一種細胞程序性死亡，由眾多基因參與其調控.從糖尿病動物實驗研究提示，心肌細胞凋亡在糖尿病心肌病的發(fā)展過程中具有重要的作用，其中Bcl-2家族與Caspase家族為細胞凋亡研究中的重點，Bcl-2作為一種抗凋亡因子，而Bax是一種促凋亡因子，正常生理狀態(tài)下Bcl-2與Bax在細胞中保持動態(tài)平衡，對細胞命運的改變具有重要意義.Caspase家族蛋白引發(fā)的級聯(lián)反應也控制著細胞凋亡過程.本研究顯示，用400 μmol/L的油酸刺激H9c2心肌細胞72 h后， Caspase 3剪切以及Bcl-2/Bax比值增加，而在NADPH氧化酶抑制劑DPI與油酸聯(lián)用下可逆轉上述結果，提示NADPH氧化酶的激活參與心肌細胞凋亡.

綜上所述，油酸刺激可抑制H9c2心肌細胞的增殖、氧化脅迫增加并誘導細胞走向死亡，但其確切機制尚未闡明.糖尿病的發(fā)病過程中不僅是心肌細胞受損，同時伴隨著胰島β細胞等發(fā)生凋亡[22].機體內能量平衡極為重要，線粒體作為細胞內能量制造中心，可維持細胞正常運轉.脂肪酸氧化的場所是線粒體，油酸刺激或可引起線粒體功能受損.過量脂肪酸通過β氧化產生大量的乙酰輔酶A，高水平的還原粒將線粒體內膜的泛醌還原為氫醌，并產生大量活性氧.而高水平的ROS可直接損傷線粒體DNA，線粒體生物發(fā)生過程受到抑制，導致線粒體膜通透性轉換孔打開，細胞色素C釋放到胞質中從而引起Caspase家族引起級聯(lián)反應，致使細胞凋亡.這為脂毒性損傷細胞確切機制的研究提供了新的思路.

5 結 論

高脂刺激可誘導心肌細胞發(fā)生氧化脅迫損傷，并確定其發(fā)生氧化脅迫源頭為 NADPH 氧化酶.高脂刺激可引起心肌細胞增殖抑制，并呈時間與濃度依賴性的方式誘導心肌細胞凋亡，最終致使心肌細胞走向死亡.