重組蛋白類(lèi)藥物蛋白含量測(cè)定方法探究

李昊娜，許宏

（1.上海健康醫(yī)學(xué)院，上海 201318；2.甘肅省武威市天祝藏族自治縣第一中學(xué)，甘肅 武威 733200）

0 引言

重組蛋白是以重組DNA 或重組RNA 技術(shù)為基礎(chǔ)而獲得的一種蛋白質(zhì)，重組蛋白類(lèi)藥物的研制與應(yīng)用，為很多患者疾病治療過(guò)程中帶來(lái)了“曙光”，并且在政策、市場(chǎng)需求等因素的作用下，重組蛋白類(lèi)藥物的發(fā)展逐漸步入至“黃金時(shí)期”。加強(qiáng)重組蛋白類(lèi)藥物質(zhì)量控制，是其是否能成功、順利上市的決定因素[1]。蛋白含量檢測(cè)是重組蛋白類(lèi)藥物質(zhì)控的關(guān)鍵內(nèi)容之一，但部分工作人員還不能嫻熟操作相關(guān)方法，鑒于此本文對(duì)幾種蛋白測(cè)量的常規(guī)方法作出探究。

1 重組蛋白類(lèi)藥物

重組蛋白類(lèi)藥物可以被視為由基因工程技術(shù)整改的“工程菌”或者是“工程細(xì)胞”大量表達(dá)出的機(jī)體功能性蛋白或相應(yīng)的突變體，這樣機(jī)體因?yàn)橄忍旎蛉毕莼蚝筇煨约膊〉纫鸬膶?duì)應(yīng)功能蛋白缺失便實(shí)現(xiàn)了有效“補(bǔ)救”。既往國(guó)內(nèi)外有很多學(xué)者指出[2]，建設(shè)完善化的質(zhì)控體系有益于掃平重組蛋白類(lèi)藥物上市過(guò)程中的各類(lèi)障礙，而蛋白含量檢測(cè)是該類(lèi)藥物質(zhì)控體系的關(guān)鍵指標(biāo)之一，和活性測(cè)算、殘余雜質(zhì)控制及成品分裝相比較，蛋白含量檢測(cè)具有更大的現(xiàn)實(shí)意義。

2 蛋白定量檢測(cè)的常規(guī)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)定量法

①凱氏定氮法:使用該種方法檢測(cè)藥物蛋白含量，是基于分析含氮量進(jìn)行的，反應(yīng)進(jìn)行過(guò)程中耗損掉的鹽酸滴定液可以追溯到質(zhì)量恒定時(shí)無(wú)水碳酸鈉對(duì)應(yīng)重量，可以將其設(shè)為含量標(biāo)準(zhǔn)品追溯始源的手段。大部分情況下，充足蛋白類(lèi)藥物的純度處于較高水平，采用該種方法測(cè)量蛋白含量，不必顧慮他類(lèi)含氮物質(zhì)對(duì)測(cè)量結(jié)果精度形成的影響。但是若在制劑期間采用了含氮添加劑，則此時(shí)蛋白含量是總氮量與非蛋白氮量?jī)烧叩牟钪?。因?yàn)閯P氏定氮法是利用含氮量將蛋白含量換算出來(lái)，在具體實(shí)踐中應(yīng)結(jié)合蛋白分子式準(zhǔn)確計(jì)算出換算系數(shù)F。

②氨基酸分析法:該定量檢測(cè)方法的功能在于能測(cè)量出構(gòu)成蛋白質(zhì)的各種氨基酸所占比重。在具體檢測(cè)時(shí)，通常會(huì)應(yīng)用以液相為基礎(chǔ)的常規(guī)酸解法。先對(duì)蛋白樣品實(shí)施酸水解處理，由此獲得游離氨基酸溶液，繼而在異硫氰酸苯酷（PITC）的協(xié)助下實(shí)現(xiàn)柱前衍生，此時(shí)氨基酸附帶了疏水結(jié)構(gòu)和吸收基團(tuán)，最后在液相的支撐下實(shí)現(xiàn)精確分離與檢測(cè)。這在計(jì)算環(huán)節(jié)中，建議先使用混標(biāo)實(shí)現(xiàn)對(duì)各個(gè)氨基酸的定量，再利用多個(gè)公式測(cè)得蛋白含量指標(biāo)。因?yàn)楦靼被岬乃獬潭却嬖诓町?，為保證蛋白含量檢測(cè)結(jié)果的精確度，建議計(jì)算在水解內(nèi)穩(wěn)定、在蛋白內(nèi)含量較高、分離度與回收率較高的氨基酸中進(jìn)行。凱氏定氮法和氨基酸分析法均是當(dāng)下國(guó)內(nèi)外認(rèn)可的檢測(cè)蛋白含量“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]，前種方法使用時(shí)最大的不足是需要投放較多的樣品，一次測(cè)量大概耗損20 mg蛋白，而后者不適用于測(cè)量高度糖基化蛋白樣品的蛋白含量。

2.2 比色分析法

已有大量研究證實(shí)[4]，Lowry 法、雙縮脈法、BCA法及Bradford 法均是基于蛋白內(nèi)特殊氨基酸或基團(tuán)的呈色反應(yīng)，采用對(duì)比顯色深度的形式確定蛋白含量。應(yīng)用該種方法測(cè)量蛋白含量時(shí)，選擇適宜的標(biāo)準(zhǔn)樣品是影響定量檢測(cè)結(jié)果精確度的重要因素。以往通常會(huì)將牛血清白蛋白、人白蛋白設(shè)為替代標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)蛋白含量定量檢測(cè)，但不同蛋白的氨基酸分子構(gòu)成、理化性質(zhì)存在差異，很可能形成偏差，故而不能真切的呈現(xiàn)出待測(cè)樣品的實(shí)際含量。

筆者認(rèn)為，只有應(yīng)用和待檢樣品材質(zhì)等同的原料，并將其設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)品，打造同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，方可規(guī)避由以上情況產(chǎn)生的偏差。但是針對(duì)初期研發(fā)的種族蛋白藥物，獲取同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品存在較大難度，這在很大程度上限制了該種方法的推廣。但是若能獲取同質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)“標(biāo)準(zhǔn)定量法”對(duì)其進(jìn)行標(biāo)定處理以后，便可以采用該類(lèi)方法常規(guī)檢測(cè)蛋白含量。

另外，和其他方法相比較，比色分析法在使用過(guò)程中形成的蛋白一染料復(fù)合物的消光系數(shù)處于較高水平，這有益于提升檢測(cè)結(jié)果的靈敏度，故而該種方法在蛋白質(zhì)微量檢測(cè)領(lǐng)域體現(xiàn)出良好效能。但多種干擾物質(zhì)會(huì)干擾這種方法的應(yīng)用過(guò)程，故而應(yīng)以最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度加以選擇應(yīng)用。

2.3 紫外吸收法

因?yàn)門(mén)rp、Tyr 及Phe 結(jié)構(gòu)內(nèi)苯環(huán)含有共扼雙鍵，故而蛋白質(zhì)在280 nm 位置的紫外形成了吸收特勝。依照朗伯一比爾定律，在光程和消光系數(shù)已知條件下，采用檢測(cè)蛋白樣品280 nm 處OD 指標(biāo)的形式，就可以檢測(cè)到蛋白含量。故而，采用該種方法檢測(cè)過(guò)程中，怎樣科學(xué)確定曉光系數(shù)是需重點(diǎn)考慮的問(wèn)題之一。歷經(jīng)周密性的文獻(xiàn)調(diào)查研究，本文把當(dāng)下確定蛋白消光系數(shù)的方法總結(jié)為如下四種類(lèi)型，涵蓋了一種經(jīng)驗(yàn)公式法與三種試驗(yàn)檢測(cè)法。

（1）經(jīng)驗(yàn)公式法。EDELHOCH[5]提出并證實(shí)了在6mol/L 鹽酸胍變性處置條件下，Trp、Tyr、S-S 模型化合物可用于等同條件下他類(lèi)非折疊蛋白的消光系數(shù)。為能精確測(cè)算出臨近自然折疊狀態(tài)下蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的消光系數(shù)，PACE 等[6]對(duì)公式內(nèi)三種氨基酸的消光系數(shù)予以校正處理，并賦予新值，最后獲得了（1）式:

其中，5500、1490、125 對(duì)應(yīng)的依次是Trp、Tyr、S-S校正處理后的摩爾消光系數(shù)。

基于該種方法獲得的消光系數(shù)一般被統(tǒng)一稱(chēng)之為理論消光系數(shù)，其和鹽酸胍變性法獲得的消光系數(shù)偏差約為4.0%。蛋白質(zhì)氨基酸構(gòu)成內(nèi)色氨酸含量高低是影響偏差值高低的主要因素，偏差大小和色氨酸含量間呈反比例關(guān)系。若蛋白質(zhì)氨基酸構(gòu)成內(nèi)無(wú)色氨酸，則偏差值通常＞10.0%，對(duì)其成因加以分析，主要和色氨酸消光系數(shù)偏高、對(duì)蛋白于280nm 位置吸光度貢獻(xiàn)偏大存在相關(guān)性，并且診斷酸堿度、溫度條件改變過(guò)程均沒(méi)有表現(xiàn)出較高敏感性。

（2）鹽酸胍變性法。盡管該方法也是基于Edelhoch構(gòu)建了Trp、Tyr、S-S，但和經(jīng)驗(yàn)公式法相比較，該法應(yīng)用階段分析了氨基酸周遭環(huán)境對(duì)其吸收值高低形成的影響，這提示利用該種方法檢測(cè)到消光系數(shù)和自然折疊狀態(tài)下蛋白質(zhì)的消光系數(shù)相似度更高。

為方便理解，筆者在這里簡(jiǎn)要闡述如下操作方法:首先把同一蛋白溶液均等的氛圍兩種，一份加入6mol/L 鹽酸胍溶液（將其標(biāo)記成6MG），另一份加入等體積的配方緩沖液，有cnat=C6MG，也有ε280nat=ε280 6MG ×Anat/A6MG。其中，有ε280 6MG=a×εTyr+b×εTrp+c×TrpCystina=a×1285+b×5685+c×125。最終獲得配方緩沖液內(nèi)天然態(tài)對(duì)應(yīng)的消光系數(shù)用公式（2）表示[6]:

其中，1285、5685、125 對(duì)應(yīng)的是6mol/L 鹽酸胍溶液內(nèi)Trp、Tyr、S-S 于280 nm 位置的摩爾消光系數(shù)。

（3）堿水解法。Goodwin、Morton 共同建設(shè)以基于堿水解條件下的二元模型，等同于蛋白質(zhì)在0.1 mol/L NaOH 溶液內(nèi)發(fā)生堿性水解反應(yīng)，可以將蛋白質(zhì)溶液視作為T(mén)rp 與Tyr 的二元體系 。具體操作方法和鹽酸胍變性法之間有很大相似處，最后獲得配方緩沖液內(nèi)天然態(tài)蛋白的消光系數(shù)用（3）式表示:

1576、5250 對(duì)應(yīng)是分別是0.1mol/L NaOH 溶液內(nèi)Trp、Tyr 于280nm 位置的摩爾消光系數(shù)。

（4）氨基酸分析法。可以利用蛋白質(zhì)的序列信號(hào)捕獲消光系數(shù)，也可以通過(guò)測(cè)算相關(guān)蛋白的氨基酸分析結(jié)果獲得。盡管前種方法應(yīng)用流程更具簡(jiǎn)潔性，但現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中也有很大局限性，這主要是由于在蛋白成品制劑內(nèi)，摻和輔助用料以及添加劑，能驅(qū)動(dòng)供試樣品酸堿度（pH值）發(fā)生改變過(guò)程，對(duì)酪氨酸殘基的離子態(tài)形成一定影響，進(jìn)而作用于蛋白吸光度指標(biāo)。這就預(yù)示著采用氨基酸分析法能獲得精確度更高的消光系數(shù)。

該法先利用氨基酸分析法定量檢測(cè)蛋白，而后基于朗伯-比爾定律測(cè)得精確度較高的消光系數(shù)，即為公式（4）[7]:

和其他幾種方法相比較，紫外線吸收法具有操作過(guò)程簡(jiǎn)易、資金投入量少、不形成污染、定量檢測(cè)后樣品可以回收使用等諸多優(yōu)勢(shì)。采用經(jīng)驗(yàn)公式法、鹽酸胍變性法、氨基酸分析法及堿水解法能較準(zhǔn)確的測(cè)定蛋白消光系數(shù)，彌補(bǔ)了蛋白定量不精確的缺陷。另外，利用基因重組技術(shù)制得的重組蛋白類(lèi)藥物，序列信息大體上是已知的，這在很大程度上降低了消光系數(shù)獲得的難度，這也是紫外線法在重組蛋白類(lèi)藥物蛋白含量檢測(cè)中廣泛應(yīng)用的主要原因之一。但是針對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)無(wú)色氨酸、酪氨酸的重組蛋白類(lèi)藥物，紫外線吸收法不能體現(xiàn)出良好適用性。

在確定消光系數(shù)過(guò)程中，應(yīng)予以如下問(wèn)題一定重視:經(jīng)驗(yàn)公式法應(yīng)用過(guò)程中無(wú)需開(kāi)展實(shí)驗(yàn)操作，僅需明確蛋白內(nèi)Trp、Tyr、S-S 數(shù)目就能測(cè)算出消光系數(shù)，也可以把DNA 序列輸送至生物信息學(xué)軟件（ExPASy）直接捕獲，但是缺點(diǎn)是該種方法在很大程度上沒(méi)有考慮蛋白三維空間結(jié)構(gòu)對(duì)消光系數(shù)做出的貢獻(xiàn)。而三種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)法較好的彌補(bǔ)了該方面存在的不足，都分析到蛋白空間結(jié)構(gòu)形成的影響，故而測(cè)算出的消光系數(shù)合自然折疊狀態(tài)毗鄰度更高，特別是利用氨基酸分析法能獲得準(zhǔn)確度更高的消光系數(shù)。故而，推薦在現(xiàn)實(shí)運(yùn)用階段，增設(shè)了對(duì)消光系數(shù)的試驗(yàn)證實(shí)與對(duì)比過(guò)程。

3 紫外吸收法檢測(cè)ADC的蛋白含量

ADC 是由單抗、連接子及小分子藥物共同構(gòu)成組裝體，單抗于280 nm 位置形成紫外吸收狀況之外，小分子藥物通常也會(huì)形成較明顯的紫外吸收情況。故而，若直接采用單抗消光系數(shù)去測(cè)算ADC 的蛋白含量，結(jié)果精確度并不高。

本文在這里提及的內(nèi)容是，朗伯一比爾定律對(duì)單組分體系的適用性欠佳，而在多組分體系內(nèi)體現(xiàn)出較好的效能，若已知這些組分存有不同的吸收光譜并且組分間未形成相互作用，則在設(shè)定的波長(zhǎng)（λ）下，該溶液對(duì)應(yīng)的總吸光度是各組分單個(gè)吸光度之和可用（5）表示[8]:

結(jié)合以上原理，抗體在280 nm 處形成特征性吸收峰，基于此形成特定的消光系數(shù)E280 mAb，小分子藥物在其吸收波長(zhǎng)最大值位置存有特異性吸收峰，也會(huì)形成特定的消光系數(shù)Eλ（D） drug。同理，抗體與波長(zhǎng)λ（D）有對(duì)應(yīng)的消光系數(shù)E}λ（D） mAb，小分子藥物于280 nm 波長(zhǎng)處存有消光系數(shù)E280 drug。針對(duì)ADC 于280 nm 及λ（D）波長(zhǎng)處形成的吸收值分別檢測(cè)，能夠求算出抗體濃度[6]。

除此之外，如果小分子藥物與連接子于280 nm 位置均未產(chǎn)生吸收現(xiàn)象，則兩者形成的影響可以忽略不計(jì)，這提示可以直接采用單抗的消光系數(shù)測(cè)算出ADC的蛋白含量。該種方法也經(jīng)常被用來(lái)檢測(cè)ADC 藥物的DAR 值。

4 結(jié)論

本文闡述了當(dāng)下檢測(cè)重組蛋白類(lèi)藥物蛋白含量的常用方法，這些方法對(duì)樣品的純度提出較高要求，并且所罕有的敷料不能對(duì)檢測(cè)過(guò)程形成擾亂，在經(jīng)純化處理的樣品中體現(xiàn)出較好的適用性。而針對(duì)非目標(biāo)蛋白含量較高的樣品或者輔料內(nèi)含有添加蛋白的成品，則一定要使用特異性較強(qiáng)的方法檢測(cè)蛋白含量，比如免疫學(xué)檢測(cè)法、HPLC 法等。利用紫外吸收法檢測(cè)ADC 含量時(shí)，應(yīng)全面分析單抗、連接子等對(duì)應(yīng)的紫外吸收特性，進(jìn)而從根本上保證蛋白質(zhì)含量檢測(cè)結(jié)果的精確度。